iPSC 衍生的上皮细胞、间充质细胞、内皮细胞和免疫细胞共培养，以模拟肺部健康和疾病中的气道屏障完整性

我的研究重点是了解人类气道重塑。人体气道是抵御环境毒素（包括病毒、空气污染和烟草烟雾）的屏障。这些毒素会伤害气道，使它们发生变化或重塑，使呼吸困难。

该模型系统不仅包括形成屏障的上皮细胞，还包括在气道稳态中很重要的其他细胞，包括血管细胞和称为巨噬细胞的免疫细胞。目前的实验挑战包括在体外模型系统中对人肺进行建模。获得原代肺样本很困难，而且培养也非常困难。

因此，使用干细胞来源的肺气道细胞与内皮细胞和巨噬细胞是克服这些挑战的下一步。首先，用每毫升 4 毫克的细胞外基质溶液或 ECM 包被 3 微米孔径聚酯细胞培养小室的顶端。移出残留的 ECM 溶液。

然后将板放入 37 摄氏度的培养箱中 1 小时。使用干净的镊子，将细胞培养小室从 12 孔板无菌转移到大培养皿中。接下来，用 ECM 溶液包被细胞培养小室的基底外侧。

吸走残留的 ECM 溶液后，将培养皿放入 37 摄氏度的培养箱中干燥过夜。用 PBS 洗涤含有 iPSC 来源的内皮细胞的 T75 培养瓶。吸出溶液后，向培养瓶中加入 5 mL 胰蛋白酶样蛋白酶，并在 37 摄氏度下孵育 8 分钟。

轻敲培养瓶以确保内皮细胞分离。然后将细胞转移到 15 毫升锥形管中。加入 5 毫升终止培养基以停止解离。

然后，将细胞以 300 G 离心 5 分钟。吸出上清液后，将细胞沉淀重悬于 1 毫升含有 10 微摩尔 ROCK 抑制剂的内皮培养基中。分装出 150， 000 个细胞后，重悬于 100 微升培养基中，并移液到倒置的细胞培养插入物上，基底外侧朝上。

小心地将细胞转移到培养箱中，并保持 3 小时不受干扰。接下来，在 12 孔板中，向每个孔中加入 1 毫升内皮培养基。从培养箱中取出带有内皮细胞的培养皿。

使用干净的镊子，小心地将细胞培养小室转移到装有内皮培养基的板中。目视验证内皮细胞已粘附后，将板置于 37 摄氏度的培养箱中过夜。从 ECM 聚合物中分离类器官并胰蛋白酶消化 15-20 分钟后，加入 3 mL 终止剂培养基以终止蛋白酶反应。

使用 P1000 移液器重悬溶液，并以 400 G 离心 5 分钟。然后，从气道类器官中吸出上清液，并将类器官重悬于 1 毫升含有 10 微摩尔 ROCK 抑制剂的气道扩张培养基中。取 10 μL 样品进行血细胞计数器细胞计数，并在计数过程中将剩余细胞置于冰上。

接下来，每 12 毫米细胞培养插入物在 500 微升气道扩增培养基中接种 300， 000 个 iPSC 来源的气道细胞。从 37 摄氏度培养箱中取出带有含有内皮细胞的细胞培养小室的板。重悬 iPSC 气道细胞，并将含有 300， 000 个细胞的 500 微升移液管到每个细胞培养插入物的顶腔中。

将板置于 37 摄氏度的培养箱中 48 小时，将顶端细胞保持在液-液条件下。孵育后，从细胞培养小室的顶端侧去除培养基。将基底外侧培养基更换为气道分化培养基和内皮培养基的 1：1 混合物。

将板放回培养箱中。使用细胞刮刀从培养瓶中解离 iPSC 衍生的巨噬细胞。以 300 G 离心 5 分钟。

之后，吸出上清液。然后将 iPSC 巨噬细胞重悬于 1 ml MAC-CM2 培养基中。取 10 μL 样品进行细胞计数，并在计数过程中将剩余的细胞置于冰上。

计数后，将 300， 000 个巨噬细胞转移到 1.5 毫升微量离心管中。将试管以 200 G 离心 5 分钟。离心后，从试管中吸出上清液。

从培养箱中取出含有内皮细胞和气道细胞共培养物的插入片段。将 300， 000 个巨噬细胞在 35 微升 MAC-CM2 中接种到细胞培养插入物的顶端侧。