Мои исследования сосредоточены на понимании ремоделирования дыхательных путей человека. Дыхательные пути человека служат барьером для токсинов окружающей среды, включая вирусы, загрязнение воздуха и табачный дым. Эти токсины могут повредить дыхательные пути, заставляя их изменяться или реконструировать, затрудняя дыхание.
Модельная система включает в себя не только эпителиальные клетки, которые образуют барьер, но и другие клетки, которые играют важную роль в гомеостазе дыхательных путей, включая клетки кровеносных сосудов и иммунные клетки, называемые макрофагами. Текущие экспериментальные задачи включают моделирование легкого человека в модельной системе in vitro. Получение первичных образцов легких затруднено, и их также очень трудно культивировать.
Таким образом, использование клеток дыхательных путей, полученных из стволовых клеток, с эндотелиальными клетками и макрофагами, является следующим шагом в преодолении этих проблем. Для начала покройте апикальную сторону 3-микрометровых вставок из полиэфирных клеточных культур 4 миллиграммами на миллилитр раствора внеклеточного матрикса, или ECM. Выведите остатки раствора ЭХМ пипеткой.
Затем поместите тарелку в инкубатор на 1 час при температуре 37 градусов Цельсия. С помощью чистого пинцета стерильно перенесите вкладыши клеточных культур из 12-луночного планшета в большую чашку Петри. Затем покройте базолатеральную сторону вставок для клеточных культур раствором ECM.
После пипетирования остатков раствора ECM поместите чашку Петри в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия для сушки на ночь. Промойте колбу T75, содержащую эндотелиальные клетки, полученные из iPSC, PBS. После отсасывания раствора добавьте в колбу 5 миллилитров трипсиноподобной протеазы и выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 8 минут.
Постучите по колбе, чтобы убедиться, что эндотелиальные клетки отделились. Затем переложите клетки в коническую трубку объемом 15 миллилитров. Добавьте 5 миллилитров стоп-среды, чтобы остановить диссоциацию.
После этого центрифугируйте клетки при 300 G в течение 5 минут. После того, как надосадочная жидкость будет аспирирована, повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1 миллилитре эндотелиальной питательной среды, содержащей 10 микромоляров ингибитора ROCK. После выделения 150 000 клеток повторно суспендируйте в 100 микролитрах среды и нанесите пипеткой на инвертированную клеточную культуру базолатеральной стороной вверх.
Осторожно перенесите клетки в инкубатор и оставьте их в покое на 3 часа. Далее в 12-луночный планшет добавьте по 1 миллилитру эндотелиальной питательной среды в каждую лунку. Достаньте из инкубатора чашку Петри с эндотелиальными клетками.
С помощью чистого пинцета осторожно перенесите вставки клеточных культур в пластину с эндотелиальными культуральными средами. После визуальной проверки того, что эндотелиальные клетки прилипли, поместите планшет в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на ночь. После выделения органоидов из полимера ECM и трипсинизации их в течение 15-20 минут добавьте 3 миллилитра стоп-среды для остановки реакции протеазы.
Повторно суспендируйте раствор с помощью пипетки P1000 и центрифугируйте при 400 G в течение 5 минут. Затем аспирируйте надосадочную жидкость из органоидов дыхательных путей и ресуспендируйте органоиды в 1 миллилитр среды расширения дыхательных путей с 10 микромолярами ингибитора ROCK. Возьмите образец объемом 10 микролитров для подсчета клеток гемоцитометра и поместите оставшиеся клетки на лед во время подсчета.
Далее засемените 300 000 клеток дыхательных путей, полученных из iPSC, в 500 микролитрах среды для расширения дыхательных путей на 12-миллиметровую вставку клеточной культуры. Извлеките планшет с вкладышами для клеточных культур, содержащими эндотелиальные клетки, из инкубатора при температуре 37 градусов Цельсия. Ресуспендируйте клетки дыхательных путей iPSC и пипетку объемом 500 микролитров, содержащую 300 000 клеток, в апикальную камеру каждой вставки для клеточной культуры.
Поместите планшет в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на 48 часов, поддерживая апикальные клетки в жидкостно-жидкостных условиях. После инкубации удалите среду с апикальной стороны вкладыша для клеточной культуры. Замените базолатеральную среду на смесь среды для дифференцировки дыхательных путей и среды для эндотелиальных культур в соотношении 1:1.
Верните тарелку в инкубатор. Диссоциируйте макрофаги, полученные из iPSC, из колбы с помощью клеточного скребка. Центрифугируйте при 300 G в течение 5 минут.
После этого отсасывайте надосадочную жидкость. Затем ресуспендируют макрофаги iPSC в 1 миллилитр среды MAC-CM2. Возьмите образец объемом 10 микролитров для подсчета клеток и поместите оставшиеся клетки на лед во время подсчета.
После подсчета перенесите 300 000 макрофагов в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Центрифугируйте пробирку при 200 G в течение 5 минут. После центрифугирования пипеткой выводите надосадочную жидкость из пробирки.
Извлеките из инкубатора вкладыши, содержащие кокультуры эндотелиальных клеток и клеток дыхательных путей. Засейте 300 000 макрофагов в 35 микролитрах MAC-CM2 на апикальную сторону вкладыша клеточной культуры.
