제 연구는 인간의 기도 리모델링을 이해하는 데 중점을 두고 있습니다. 인간의 기도는 바이러스, 대기 오염 및 담배 연기를 포함한 환경 독소에 대한 장벽 역할을 합니다. 이러한 독소는 기도를 손상시켜 기도를 변화시키거나 리모델링하여 숨쉬기 어렵게 만들 수 있습니다.
모델 시스템에는 장벽을 형성하는 상피 세포뿐만 아니라 혈관 세포 및 대식세포라고 하는 면역 세포를 포함하여 기도 항상성에 중요한 다른 세포가 포함됩니다. 현재 실험 과제에는 체외 모델 시스템에서 인간 폐를 모델링하는 것이 포함됩니다. 1차 폐 샘플을 채취하는 것은 어렵고 배양하는 것도 매우 어렵습니다.
따라서 내피 세포와 대식세포가 주입된 줄기세포 유래 폐기도 세포를 사용하는 것이 이러한 문제를 극복하기 위한 다음 단계입니다. 먼저 3마이크로미터 공극 폴리에스테르 세포 배양 삽입물의 정점 면에 4밀리그램/밀리그램의 세포외 기질 용액(ECM)을 코팅합니다. 잔류 ECM 용액을 피펫팅합니다.
그런 다음 플레이트를 섭씨 37도에서 1시간 동안 인큐베이터에 넣습니다. 깨끗한 핀셋을 사용하여 12웰 플레이트의 세포 배양 삽입물을 대형 페트리 접시로 멸균 상태로 옮깁니다. 다음으로, 세포 배양 삽입물의 기저측 면을 ECM 용액으로 코팅합니다.
잔류 ECM 용액을 피펫으로 제거한 후 페트리 접시를 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣어 밤새 건조시킵니다. iPSC 유래 내피 세포가 포함된 T75 플라스크를 PBS로 세척합니다. 용액을 흡입한 후 플라스크에 트립신과 같은 프로테아제 5ml를 넣고 섭씨 37도에서 8분 동안 배양합니다.
플라스크를 두드려 내피 세포가 분리되도록 합니다. 그런 다음 세포를 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 해리를 중지하기 위해 5ml의 정지 매체를 추가합니다.
그런 다음 300G에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 상층액이 흡인되면 10마이크로몰의 ROCK 억제제를 포함하는 1ml의 내피 배양 배지에 세포 펠렛을 다시 현탁시킵니다. 150, 000 세포를 분주한 후 100 마이크로리터의 배지와 피펫을 기저측 면이 위를 향하도록 하여 거꾸로 된 세포 배양 삽입물에 다시 현탁합니다.
세포를 조심스럽게 인큐베이터로 옮기고 3시간 동안 방해받지 않고 그대로 두십시오. 다음으로, 12웰 플레이트에 1ml의 내피 배양 배지를 각 웰에 추가합니다. 인큐베이터에서 내피 세포가 있는 페트리 접시를 꺼냅니다.
깨끗한 핀셋을 사용하여 세포 배양 삽입물을 내피 배양 배지가 있는 플레이트로 조심스럽게 옮깁니다. 내피 세포가 부착되었는지 육안으로 확인한 후 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 밤새 넣습니다. ECM 폴리머에서 오가노이드를 분리하고 15-20분 동안 트립신화한 후 3ml의 정지 매체를 첨가하여 프로테아제 반응을 중단합니다.
P1000 피펫과 원심분리기를 사용하여 400G에서 5분 동안 용액을 재현탁합니다. 그런 다음 기도 오가노이드에서 상층액을 흡인하고 10마이크로몰의 ROCK 억제제와 함께 1ml의 기도 확장 매체에 오가노이드를 재현탁합니다. 혈구계 세포 계수를 위해 10마이크로리터 샘플을 채취하고 계수하는 동안 나머지 세포를 얼음 위에 놓습니다.
다음으로 12mm 세포 배양 삽입물당 500마이크로리터의 기도 확장 배지에 300,000개의 iPSC 유래 기도 세포를 파종합니다. 섭씨 37도의 인큐베이터에서 내피 세포가 포함된 세포 배양 삽입물이 있는 플레이트를 제거합니다. iPSC 기도 세포와 300, 000 세포가 포함된 500 마이크로리터를 각 세포 배양 삽입물의 정점 챔버에 재현탁합니다.
플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 48시간 동안 놓고 정점 세포를 액체-액체 상태로 유지합니다. 배양 후 세포 배양 삽입물의 정점 쪽에서 배지를 제거합니다. 기저측 배지를 기도 분화 배지와 내피 배양 배지의 1:1 혼합물로 변경합니다.
플레이트를 인큐베이터에 다시 넣습니다. 세포 스크레이퍼를 사용하여 플라스크에서 iPSC 유래 대식세포를 해리합니다. 300g에서 5분간 원심분리기합니다.
그 후, 상등액을 흡인하십시오. 그런 다음 1ml의 MAC-CM2 배지에 iPSC 대식세포를 재현탁시킵니다. 세포 계수를 위해 10마이크로리터 샘플을 채취하고 계수하는 동안 나머지 세포를 얼음 위에 놓습니다.
계산 후에, 300, 000의 대식 세포를 1.5 밀리리터 마이크로 분리기 관으로 옮기십시오. 튜브를 200G에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 튜브에서 상층액을 피펫으로 제거합니다.
인큐베이터에서 내피 세포와 기도 세포의 공동 배양이 포함된 삽입물을 제거합니다. 300, 000 대 식 세포를 35 마이크로 리터의 MAC-CM2를 세포 배양 삽입물의 정점면에 파종합니다.
