Araştırmam, insan hava yolunun yeniden şekillenmesini anlamaya odaklanıyor. İnsan hava yolu, virüsler, hava kirliliği ve tütün dumanı dahil olmak üzere çevresel toksinlere karşı bir bariyer görevi görür. Bu toksinler hava yoluna zarar verebilir, değişmelerine veya yeniden şekillenmelerine neden olarak nefes almayı zorlaştırabilir.
Model sistem sadece bariyeri oluşturan epitel hücrelerini değil, aynı zamanda kan damarı hücreleri ve makrofaj adı verilen bağışıklık hücreleri de dahil olmak üzere hava yolu homeostazında önemli olan diğer hücreleri de içerir. Mevcut deneysel zorluklar, insan akciğerinin in vitro model bir sistemde modellenmesini içerir. Birincil akciğer örneklerinin alınması zordur ve kültürlenmesi de çok zordur.
Bu nedenle, endotel hücreleri ve makrofajlarla yatırım yapılan kök hücre kaynaklı akciğer hava yolu hücrelerinin kullanılması, bu zorlukların üstesinden gelmek için bir sonraki adımdır. Başlamak için, 3 mikrometre gözenekli polyester hücre kültürü eklerinin apikal tarafını mililitre hücre dışı matris çözeltisi veya ECM başına 4 miligram ile kaplayın. Kalan ECM solüsyonunu pipetle boşaltın.
Ardından plakayı 37 santigrat derecede 1 saat boyunca inkübatöre yerleştirin. Temiz cımbız kullanarak, hücre kültürü eklerini 12 oyuklu plakadan steril bir şekilde büyük bir Petri kabına aktarın. Daha sonra, hücre kültürü eklerinin bazolateral tarafını ECM çözeltisi ile kaplayın.
Kalan ECM solüsyonunu pipetledikten sonra, Petri kabını gece boyunca kuruması için 37 derecelik bir inkübatöre koyun. iPSC'den türetilmiş endotel hücreleri içeren T75 şişesini PBS ile yıkayın. Çözeltiyi aspire ettikten sonra, şişeye 5 mililitre tripsin benzeri proteaz ekleyin ve 37 santigrat derecede 8 dakika inkübe edin.
Endotel hücrelerinin ayrıldığından emin olmak için şişeye dokunun. Daha sonra hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Ayrışmayı durdurmak için 5 mililitre durdurma ortamı ekleyin.
Daha sonra hücreleri 300 G'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatan aspire edildikten sonra, hücre peletini 10 mikromolar ROCK inhibitörü içeren 1 mililitre endotel kültür ortamında yeniden süspanse edin. 150.000 hücreyi ayırdıktan sonra, 100 mikrolitre besiyerinde yeniden süspanse edin ve bazolateral tarafı yukarı bakacak şekilde ters çevrilmiş hücre kültürü ekine pipetleyin.
Hücreleri dikkatlice inkübatöre aktarın ve 3 saat boyunca rahatsız edilmeden bırakın. Daha sonra, 12 oyuklu bir plakada, her oyuğa 1 mililitre endotel kültür ortamı ekleyin. Endotel hücreli Petri kabını inkübatörden çıkarın.
Temiz cımbız kullanarak, hücre kültürü eklerini endotel kültürü ortamı ile plakaya dikkatlice aktarın. Endotel hücrelerinin yapıştığını görsel olarak doğruladıktan sonra, plakayı gece boyunca 37 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Organoidleri ECM polimerinden izole ettikten ve 15-20 dakika tripsinizledikten sonra, proteaz reaksiyonunu durdurmak için 3 mililitre durdurma ortamı ekleyin.
Çözeltiyi bir P1000 pipeti kullanarak yeniden süspanse edin ve 400 G'de 5 dakika santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanı hava yolu organoidlerinden aspire edin ve organoidleri 10 mikromolar ROCK inhibitörü ile 1 mililitre hava yolu genişleme ortamında yeniden süspanse edin. Hemositometre hücre sayımı için 10 mikrolitrelik bir numune alın ve sayım sırasında kalan hücreleri buzun üzerine yerleştirin.
Daha sonra, 12 milimetre hücre kültürü eki başına 500 mikrolitre hava yolu genişletme ortamında 300.000 iPSC'den türetilmiş hava yolu hücresi tohumlayın. Endotel hücreleri içeren hücre kültürü eklerinin bulunduğu plakayı 37 santigrat derece inkübatörden çıkarın. iPSC hava yolu hücrelerini yeniden askıya alın ve 300.000 hücre içeren 500 mikrolitreyi her hücre kültürü ekinin apikal odasına pipetleyin.
Plakayı 48 saat boyunca 37 santigrat derece inkübatöre yerleştirin ve apikal hücreleri sıvı-sıvı koşullarında tutun. İnkübasyondan sonra, ortamı hücre kültürü ekinin apikal tarafından çıkarın. Bazolateral medyayı 1: 1 hava yolu farklılaşma medyası ve endotel kültür medyası karışımına değiştirin.
Plakayı inkübatöre geri koyun. Bir hücre kazıyıcı kullanarak iPSC'den türetilmiş makrofajları şişeden ayırın. 300 G'de 5 dakika santrifüjleyin.
Bundan sonra, süpernatanı aspire edin. Daha sonra iPSC makrofajlarını 1 mililitre MAC-CM2 ortamında yeniden süspanse edin. Hücre sayımı için 10 mikrolitrelik bir numune alın ve sayım sırasında kalan hücreleri buzun üzerine yerleştirin.
Saydıktan sonra, 300.000 makrofajı 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Tüpü 200 G'de 5 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı tüpten pipetleyin.
Endotel ve hava yolu hücrelerinin ko-kültürlerini içeren ekleri inkübatörden çıkarın. 35 mikrolitre MAC-CM2'de 300.000 makrofajı hücre kültürü ekinin apikal tarafına tohumlayın.
