La mia ricerca si concentra sulla comprensione del rimodellamento delle vie aeree umane. Le vie aeree umane fungono da barriera contro le tossine ambientali, inclusi virus, inquinamento atmosferico e fumo di tabacco. Queste tossine possono danneggiare le vie aeree, facendole cambiare o rimodellare, rendendo difficile la respirazione.
Il sistema modello include non solo le cellule epiteliali che formano la barriera, ma anche altre cellule importanti nell'omeostasi delle vie aeree, comprese le cellule dei vasi sanguigni e le cellule immunitarie chiamate macrofagi. Le attuali sfide sperimentali includono la modellazione del polmone umano in un sistema modello in vitro. Ottenere campioni di polmone primario è difficile e sono anche molto difficili da coltivare.
Pertanto, l'utilizzo di cellule delle vie aeree polmonari derivate da cellule staminali investite con cellule endoteliali e macrofagi è il passo successivo per superare queste sfide. Per iniziare, rivestire il lato apicale degli inserti per colture cellulari in poliestere con pori da 3 micrometri con 4 milligrammi per millilitro di soluzione di matrice extracellulare, o ECM. Pipettare la soluzione ECM residua.
Quindi posizionare la piastra nell'incubatrice per 1 ora a 37 gradi Celsius. Utilizzando una pinzetta pulita, trasferire sterilemente gli inserti di coltura cellulare dalla piastra a 12 pozzetti a una grande piastra di Petri. Quindi, rivestire il lato basolaterale degli inserti per colture cellulari con una soluzione ECM.
Dopo aver pipettato la soluzione ECM residua, posizionare la piastra di Petri in un incubatore a 37 gradi Celsius per farla asciugare per una notte. Lavare il pallone T75 contenente cellule endoteliali derivate da iPSC con PBS. Dopo aver aspirato la soluzione, aggiungere 5 millilitri di proteasi simile alla tripsina nel pallone e incubare a 37 gradi Celsius per 8 minuti.
Battere il pallone per assicurarsi che le cellule endoteliali si stacchino. Quindi trasferire le cellule in una provetta conica da 15 millilitri. Aggiungere 5 millilitri di mezzo di arresto per arrestare la dissociazione.
Successivamente, centrifugare le celle a 300 G per 5 minuti. Una volta aspirato il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 1 millilitro di terreno di coltura endoteliale contenente 10 micromolari di inibitore di ROCK. Dopo aver aliquotato 150.000 cellule, risospendere in 100 microlitri di terreno e pipettare sull'inserto di coltura cellulare capovolto con il lato basolaterale rivolto verso l'alto.
Trasferire con cura le cellule nell'incubatrice e lasciarle indisturbate per 3 ore. Successivamente, in una piastra a 12 pozzetti, aggiungere 1 millilitro di terreno di coltura endoteliale a ciascun pozzetto. Rimuovere la capsula di Petri con le cellule endoteliali dall'incubatrice.
Utilizzando una pinzetta pulita, trasferire con cura gli inserti di coltura cellulare nella piastra con terreni di coltura endoteliali. Dopo aver verificato visivamente che le cellule endoteliali abbiano aderito, posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius durante la notte. Dopo aver isolato gli organoidi dal polimero ECM e averli tripsinizzati per 15-20 minuti, aggiungere 3 millilitri di terreno di arresto per fermare la reazione della proteasi.
Risospendere la soluzione con una pipetta P1000 e centrifugare a 400 G per 5 minuti. Quindi, aspirare il surnatante dagli organoidi delle vie aeree e risospendere gli organoidi in 1 millilitro di mezzo di espansione delle vie aeree con 10 micromolari di inibitore ROCK. Prelevare un campione da 10 microlitri per una conta delle cellule dell'emocitometro e posizionare le cellule rimanenti sul ghiaccio durante il conteggio.
Successivamente seminare 300.000 cellule delle vie aeree derivate da iPSC in 500 microlitri di terreno di espansione delle vie aeree per inserto di coltura cellulare da 12 millimetri. Rimuovere la piastra con inserti per colture cellulari contenenti cellule endoteliali dall'incubatore a 37 gradi Celsius. Risospendere le cellule delle vie aeree iPSC e pipettare 500 microlitri contenenti 300.000 cellule nella camera apicale di ciascun inserto di coltura cellulare.
Posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per 48 ore, mantenendo le cellule apicali in condizioni liquido-liquido. Dopo l'incubazione, rimuovere il terreno dal lato apicale dell'inserto di coltura cellulare. Sostituire il terreno basolaterale in una miscela 1:1 di terreni di differenziazione delle vie aeree e terreni di coltura endoteliale.
Rimettere la piastra nell'incubatrice. Dissociare i macrofagi derivati da iPSC dal pallone utilizzando un raschietto cellulare. Centrifugare a 300 g per 5 minuti.
Successivamente, aspirare il surnatante. Quindi risospendere i macrofagi iPSC in 1 millilitro di terreno MAC-CM2. Prelevare un campione da 10 microlitri per il conteggio delle cellule e posizionare le cellule rimanenti sul ghiaccio durante il conteggio.
Dopo il conteggio, trasferire 300.000 macrofagi in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Centrifugare la provetta a 200 G per 5 minuti. Dopo la centrifugazione, pipettare il surnatante dalla provetta.
Rimuovere dall'incubatrice gli inserti contenenti co-colture di cellule endoteliali e delle vie aeree. Seminare 300.000 macrofagi in 35 microlitri di MAC-CM2 sul lato apicale dell'inserto di coltura cellulare.
