Mi investigación se centra en la comprensión de la remodelación de las vías respiratorias humanas. Las vías respiratorias humanas sirven como barrera contra las toxinas ambientales, incluidos los virus, la contaminación del aire y el humo del tabaco. Estas toxinas pueden dañar las vías respiratorias, haciendo que cambien o se remodelen, dificultando la respiración.
El sistema modelo incluye no solo las células epiteliales que forman la barrera, sino también otras células que son importantes en la homeostasis de las vías respiratorias, incluidas las células de los vasos sanguíneos y las células inmunitarias llamadas macrófagos. Los desafíos experimentales actuales incluyen el modelado del pulmón humano en un sistema de modelos in vitro. La obtención de muestras primarias de pulmón es difícil y también son muy difíciles de cultivar.
Por lo tanto, el siguiente paso para superar estos desafíos es el uso de células de las vías respiratorias pulmonares derivadas de células madre invertidas con células endoteliales y macrófagos. Para comenzar, cubra el lado apical de los insertos de cultivo celular de poliéster de poro de 3 micrómetros con 4 miligramos por mililitro de solución de matriz extracelular, o ECM. Pipetear la solución de ECM residual.
Luego coloque la placa en la incubadora durante 1 hora a 37 grados centígrados. Con pinzas limpias, transfiera estérilmente los insertos de cultivo celular de la placa de 12 pocillos a una placa de Petri grande. A continuación, recubra el lado basolateral de los insertos de cultivo celular con una solución de ECM.
Después de pipetear la solución residual de ECM, coloque la placa de Petri en una incubadora a 37 grados Celsius para que se seque durante la noche. Lave el matraz T75 que contiene células endoteliales derivadas de iPSC con PBS. Después de aspirar la solución, agregue 5 mililitros de proteasa similar a la tripsina al matraz e incube a 37 grados centígrados durante 8 minutos.
Golpee el matraz para asegurarse de que las células endoteliales se desprendan. Luego transfiera las células a un tubo cónico de 15 mililitros. Agregue 5 mililitros de medio de parada para detener la disociación.
A continuación, centrifugar las células a 300 G durante 5 minutos. Una vez aspirado el sobrenadante, se vuelve a suspender el pellet celular en 1 mililitro de medio de cultivo endotelial que contenga 10 micromolares de inhibidor de ROCK. Después de alicuota de 150.000 células, vuelva a suspender 100 microlitros de medio y pipetee en el inserto de cultivo celular invertido con el lado basolateral hacia arriba.
Transfiera con cuidado las células a la incubadora y déjelas sin tocar durante 3 horas. A continuación, en una placa de 12 pocillos, agregue 1 mililitro de medio de cultivo endotelial a cada pocillo. Retire la placa de Petri con células endoteliales de la incubadora.
Con unas pinzas limpias, transfiera con cuidado los insertos de cultivo celular a la placa con medios de cultivo endotelial. Después de verificar visualmente que las células endoteliales se han adherido, coloque la placa en una incubadora a 37 grados centígrados durante la noche. Después de aislar los organoides del polímero ECM e tripsinizarlos durante 15-20 minutos, agregue 3 mililitros de medio de parada para detener la reacción de la proteasa.
Vuelva a suspender la solución con una pipeta P1000 y centrifugue a 400 G durante 5 minutos. A continuación, aspire el sobrenadante de los organoides de las vías respiratorias y vuelva a suspender los organoides en 1 mililitro de medio de expansión de las vías respiratorias con 10 micromolares de inhibidor de ROCK. Tome una muestra de 10 microlitros para un recuento de células de hemocitómetro y coloque las células restantes en hielo durante el recuento.
A continuación, siembre 300.000 células de vía aérea derivadas de iPSC en 500 microlitros de medio de expansión de la vía aérea por inserto de cultivo celular de 12 milímetros. Retire la placa con los insertos de cultivo celular que contienen células endoteliales de la incubadora a 37 grados centígrados. Vuelva a suspender las células de las vías respiratorias iPSC y pipetee 500 microlitros que contengan 300.000 células en la cámara apical de cada inserto de cultivo celular.
Coloque la placa en una incubadora a 37 grados centígrados durante 48 horas, manteniendo las células apicales en condiciones líquido-líquido. Después de la incubación, retire el medio del lado apical del inserto de cultivo celular. Cambie el medio basolateral a una mezcla 1:1 de medios de diferenciación de las vías respiratorias y medios de cultivo endotelial.
Regrese la placa a la incubadora. Disocie los macrófagos derivados de iPSC del matraz mediante un raspador de células. Centrifugar a 300 g durante 5 minutos.
Después de eso, aspira el sobrenadante. A continuación, vuelva a suspender los macrófagos iPSC en 1 mililitro de medio MAC-CM2. Tome una muestra de 10 microlitros para el recuento de células y coloque las células restantes en hielo durante el recuento.
Después de contar, transfiera 300.000 macrófagos a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Centrifugar el tubo a 200 g durante 5 minutos. Después de la centrifugación, pipetee el sobrenadante del tubo.
Retire de la incubadora los insertos que contienen cocultivos de células endoteliales y de las vías respiratorias. Siembre 300.000 macrófagos en 35 microlitros de MAC-CM2 en el lado apical del inserto de cultivo celular.
