המחקר שלי מתמקד בהבנת שיפוץ דרכי הנשימה האנושיות. דרכי הנשימה האנושיות משמשות כמחסום מפני רעלים סביבתיים, כולל וירוסים, זיהום אוויר ועשן טבק. רעלים אלה יכולים לפגוע בדרכי הנשימה, לגרום להם להשתנות או לעצב מחדש, מה שמקשה על הנשימה.
מערכת המודל כוללת לא רק את תאי האפיתל היוצרים את המחסום, אלא גם תאים אחרים החשובים בהומאוסטזיס של דרכי הנשימה, כולל תאי כלי דם ותאי חיסון הנקראים מקרופאגים. אתגרי הניסוי הנוכחיים כוללים מידול הריאה האנושית במערכת מודל במבחנה. קשה להשיג דגימות ריאה ראשוניות וגם קשה מאוד לתרבית אותן.
לפיכך, שימוש בתאי דרכי נשימה שמקורם בתאי גזע המושקעים בתאי אנדותל ומקרופאגים הוא הצעד הבא להתגברות על אתגרים אלה. כדי להתחיל, מצפים את הצד האפיקלי של תוספות תרבית תאי פוליאסטר נקבוביות של 3 מיקרומטר ב-4 מיליגרם למיליליטר של תמיסת מטריצה חוץ-תאית, או ECM. פיפטה את תמיסת ה-ECM הנותרת.
לאחר מכן הניחו את הצלחת בחממה למשך שעה בחום של 37 מעלות צלזיוס. בעזרת פינצטה נקייה, העבירו באופן סטרילי את תוספות תרבית התאים מצלחת 12 הבארות לצלחת פטרי גדולה. לאחר מכן, מצפים את הצד הבסיסי של תוספות תרבית התאים בתמיסת ECM.
לאחר הוצאת שאריות תמיסת ה-ECM, הניחו את צלחת הפטרי באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס לייבוש למשך הלילה. שטפו את בקבוק T75 המכיל תאי אנדותל שמקורם ב-iPSC עם PBS. לאחר שאיבת התמיסה, הוסיפו לבקבוק 5 מיליליטר פרוטאז דמוי טריפסין ודגרו בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 8 דקות.
הקש על הבקבוק כדי לוודא שתאי האנדותל מתנתקים. לאחר מכן העבירו את התאים לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. הוסף 5 מיליליטר של אמצעי עצירה כדי לעצור את הניתוק.
לאחר מכן, צנטריפוגה את התאים ב -300 גרם למשך 5 דקות. לאחר שאיבת הסופרנטנט, השעו מחדש את כדור התא ב-1 מיליליטר של מצע תרבית אנדותל המכיל 10 מיקרו-מולרי של מעכב ROCK. לאחר ציטוט של 150,000 תאים, יש להשעות מחדש 100 מיקרוליטר של מדיה ופיפטה על הכנסת תרבית התאים ההפוכה כשהצד הבסיסי פונה כלפי מעלה.
העבירו בזהירות את התאים לחממה והשאירו אותם ללא הפרעה למשך 3 שעות. לאחר מכן, בצלחת של 12 בארות הוסף 1 מיליליטר של מצע תרבית אנדותל לכל באר. הסר את צלחת הפטרי עם תאי אנדותל מהחממה.
בעזרת פינצטה נקייה, העבירו בזהירות את תוספות תרבית התאים לצלחת בעזרת אמצעי תרבית אנדותל. לאחר אימות ויזואלי שתאי האנדותל נדבקו, הנח את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר בידוד אורגנואידים מפולימר ECM וניסיון שלהם למשך 15-20 דקות, הוסף 3 מיליליטר של אמצעי עצירה כדי לעצור את תגובת הפרוטאז.
השעו מחדש את התמיסה באמצעות פיפטה P1000 וצנטריפוגה בטמפרטורה של 400 גרם למשך 5 דקות. לאחר מכן, שאפו את הסופרנטנט מהאורגנואידים של דרכי הנשימה והשעו מחדש את האורגנואידים ב-1 מיליליטר של מצע הרחבת דרכי הנשימה עם 10 מיקרו-מולרי של מעכב ROCK. קח דגימה של 10 מיקרוליטר לספירת תאי המוציטומטר והנח את התאים הנותרים על קרח במהלך הספירה.
הזרע הבא 300,000 תאי דרכי נשימה שמקורם ב-iPSC ב-500 מיקרוליטר של אמצעי הרחבת דרכי הנשימה לכל תוספת תרבית תאים של 12 מילימטר. הסר את הצלחת עם תוספות תרבית תאים המכילות תאי אנדותל מהחממה של 37 מעלות צלזיוס. השעו מחדש תאי דרכי נשימה iPSC ופיפטה 500 מיקרוליטר המכילה 300,000 תאים לתוך התא האפיקלי של כל תוספת תרבית תאים.
מניחים את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות, תוך שמירה על התאים האפיקליים בתנאים נוזליים-נוזליים. לאחר הדגירה, הסר את המדיה מהצד האפיקלי של תוספת תרבית התאים. שנה את המדיה הבסיסית לתערובת של 1:1 של אמצעי בידול דרכי הנשימה ומדיה של תרבית אנדותל.
החזירו את הצלחת לחממה. נתק מקרופאגים שמקורם ב-iPSC מהבקבוק באמצעות מגרד תאים. צנטריפוגה בחום של 300 גרם למשך 5 דקות.
לאחר מכן, שאפו את הסופרנטנט. לאחר מכן השעו מחדש מקרופאגים iPSC ב-1 מיליליטר של מדיית MAC-CM2. קח דגימה של 10 מיקרוליטר לספירת תאים והנח את התאים הנותרים על קרח במהלך הספירה.
לאחר הספירה, העבירו 300,000 מקרופאגים לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה את הצינור ב -200 גרם למשך 5 דקות. לאחר הצנטריפוגה, פיפטה החוצה את הסופרנטנט מהצינור.
הסר את התוספות המכילות תרביות משותפות של תאי אנדותל ודרכי הנשימה מהחממה. זרע 300,000 מקרופאגים ב-35 מיקרוליטר של MAC-CM2 על הצד האפיקלי של תוספת תרבית התא.
