私の研究は、人間の気道リモデリングを理解することに焦点を当てています。人間の気道は、ウイルス、大気汚染、タバコの煙などの環境毒素に対するバリアとして機能します。これらの毒素は気道を傷つけ、気道を変化させたり改造したりして、呼吸を困難にする可能性があります。
モデルシステムには、バリアを形成する上皮細胞だけでなく、血管細胞やマクロファージと呼ばれる免疫細胞など、気道の恒常性に重要な他の細胞も含まれています。現在の実験課題には、in vitroモデルシステムでのヒト肺のモデリングが含まれます。一次肺サンプルの入手は難しく、培養も非常に困難です。
したがって、幹細胞由来の肺気道細胞に内皮細胞とマクロファージを投資して使用することが、これらの課題を克服するための次のステップです。まず、3マイクロメートルの細孔ポリエステル細胞培養インサートの頂端面を、細胞外マトリックス溶液(ECM)のミリリットルあたり4ミリグラムでコーティングします。残りのECM溶液をピペットで取り出します。
次に、プレートをインキュベーターに37°Cで1時間置きます。清潔なピンセットを使用して、細胞培養インサートを12ウェルプレートから大きなペトリ皿に無菌的に移します。次に、細胞培養インサートの基底外側をECM溶液でコーティングします。
残留ECM溶液をピペッティングで取り除いた後、ペトリ皿を摂氏37度のインキュベーターに入れて一晩乾燥させます。iPS細胞由来内皮細胞を含むT75フラスコをPBSで洗浄します。溶液を吸引した後、5ミリリットルのトリプシン様プロテアーゼをフラスコに加え、摂氏37度で8分間インキュベートします。
フラスコを軽くたたいて、内皮細胞が剥離することを確認します。次に、細胞を15ミリリットルの円錐管に移します。5ミリリットルのストップメディアを追加して、解離を停止します。
その後、細胞を300Gで5分間遠心分離します。上清を吸引したら、10マイクロモルのROCK阻害剤を含む1ミリリットルの内皮培養培地に細胞ペレットを再懸濁します。150, 000個の細胞を分注した後、100マイクロリットルの培地に再懸濁し、基底外側を上にして逆さ細胞培養インサートにピペットで移します。
細胞を慎重にインキュベーターに移し、3時間放置します。次に、12ウェルプレートに1ミリリットルの内皮培養培地を各ウェルに加えます。内皮細胞の入ったペトリ皿をインキュベーターから取り出します。
清潔なピンセットを使用して、細胞培養インサートを内皮培養培地とともにプレートに慎重に移します。内皮細胞が付着していることを目視で確認した後、プレートを摂氏37度のインキュベーターに一晩置きます。ECMポリマーからオルガノイドを単離し、15〜20分間トリプシンした後、3ミリリットルの停止培地を加えてプロテアーゼ反応を停止させます。
P1000ピペットを使用して溶液を再懸濁し、400 Gで5分間遠心分離します。次に、気道オルガノイドから上清を吸引し、オルガノイドを10マイクロモルのROCK阻害剤を含む1ミリリットルの気道拡張培地に再懸濁します。血球計算盤の細胞数のために10マイクロリットルのサンプルを採取し、カウント中に残りの細胞を氷上に置きます。
次に、12ミリメートルの細胞培養インサートあたり500マイクロリットルの気道拡大培地に300,000個のiPS細胞由来気道細胞を播種します。内皮細胞を含む細胞培養インサートの入ったプレートを摂氏37度のインキュベーターから取り出します。iPSC気道細胞を再懸濁し、300, 000個の細胞を含む500マイクロリットルを各細胞培養インサートの頂端チャンバーにピペットで移します。
プレートを摂氏37度のインキュベーターに48時間置き、頂端細胞を液液状態に保ちます。インキュベーション後、細胞培養インサートの頂端側から培地を取り出します。基底外側培地を気道分化培地と内皮培養培地の1:1混合物に変更します。
プレートをインキュベーターに戻します。細胞スクレーパーを用いて、iPS細胞由来マクロファージをフラスコから解離します。300 Gで5分間遠心分離します。
その後、上清を吸引します。次に、iPSCマクロファージを1ミリリットルのMAC-CM2培地に再懸濁します。細胞計数のために10マイクロリットルのサンプルを採取し、計数中に残りの細胞を氷上に置きます。
カウント後、300, 000個のマクロファージを1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。チューブを200Gで5分間遠心分離します。遠心分離後、チューブから上清をピペットで排出します。
内皮細胞と気道細胞の共培養物を含むインサートをインキュベーターから取り出します。35マイクロリットルのMAC-CM2に300,000個のマクロファージを細胞培養インサートの頂端側に播種します。
