يتمثل نطاق بحثنا في تطوير طريقة جديدة في المختبر للتقييم السريع والحساس لسمية والسمية البيئية للملوثات بناء على تقييم حركة الخلايا الدموية ل Mytilus galloprovincialis ككائن حي نموذجي. تمثل الأساليب القائمة على التأثير ، مثل المقايسات الحيوية في المختبر وفي الجسم الحي ، أدوات مبتكرة للكشف عن آثار الملوثات الكيميائية البيئية على الكائنات الحية. يمكن أن تكون هذه الأساليب بمثابة أدوات في المراقبة البيولوجية البيئية وتقييم المخاطر.
يعالج هذا البحث فجوة كبيرة في علم السموم من خلال التركيز على استخدام حركة الخلايا الدموية كنقطة نهاية جديدة لتقييم تأثير الملوثات على بلح البحر. على الرغم من أن حركة الخلايا الدموية أمر بالغ الأهمية للاستجابات المناعية ، إلا أن حساسيتها للتعرض للملوثات غير مدروسة في ذوات الصدفتين. اكتشافنا يتقدم الأبحاث في علم السموم والسموم البيئية بعدة طرق.
من خلال تقديم نقطة نهاية جديدة لفحص السمية ، ودعم البحث الأخلاقي من خلال تقليل اختبار الفقاريات ، وتعزيز قابلية التطبيق في علم السموم البيئية. يمكن أن يكون لهذا النهج تطبيق واسع في المراقبة البيولوجية البيئية ويمكن تكييفه مع الخلايا المناعية الأخرى في علم السموم البيئية. للبدء ، املأ حقنة مسبقا ب 0.5 مل من المحلول الملحي الفسيولوجي القياسي المخفف إلى 15 درجة مئوية.
ضع عينة بلح البحر البالغ المتأقلم لمجموعة hemolymph. باستخدام مشرط ، قم بفصل الصمامات قليلا وبعناية على طول السطح البطني. حافظ على المشرط في موضعه أو استخدم طرف الماصة لإبقاء المساحة مفتوحة.
ثم أدخل إبرة حقنة تحت الجلد في الفراغ بين الصمامات. اجمع برفق 0.5 مل من الهيموليمف من العضلة المقربة الخلفية باستخدام المحقنة المعبأة مسبقا. الآن ، قم بإزالة الإبرة من المحقنة ونقل محتويات المحقنة إلى أنبوب صغير.
قم بتجميع العينات التي تم جمعها من ثلاثة إلى أربعة بلح البحر معا في أنبوب مع الحفاظ على درجة حرارة 15 درجة مئوية. بعد تقييم صلاحية الخلايا الدموية ، لزراعتها ، أضف 50 ميكرولترا من الهيموليمف المخفف في آبار صفيحة دقيقة مكونة من 96 بئرا ، ذات قاع مسطح ، بوليسترين ، معالج TC ، وقم بتغطية اللوحة بغطاءها. دع الخلايا الدموية تلتصق بقاع الآبار لمدة 30 دقيقة عند 15 درجة مئوية لتشكيل طبقة أحادية.
ثم ، باستخدام ماصة دقيقة ، قم بشفط الهيموليمف الزائد برفق من الآبار. لإجراء فحوصات قصيرة المدى في غضون ساعة إلى أربع ساعات ، أضف على الفور 100 ميكرولتر من المادة ذات الأهمية المذابة في محلول ملحي فسيولوجي. للتعرض لفترات طويلة من 24 إلى 48 ساعة ، احتضان الخلايا الملتصقة المزروعة بمادة الاختبار المذابة في وسط المزرعة المكمل عند 15 درجة مئوية.
للبدء ، احصل على الخلايا الدموية المستنبتة المعالجة بالمادة ذات الاهتمام. لتحسين تصور الخلايا الدموية ، قم بإزالة وسط الحضانة من كل بئر ، وقم بتلطيخ الخلايا ب 100 ميكرولتر من محلول تلطيخ الصبغة الحمراء الحيوية المحايدة قبل الفحص المجهري بفاصل زمني. احتضان الخلايا عند 15 درجة مئوية في غرفة مناخية لمدة 15 دقيقة.
بعد الحضانة ، اغسل الصبغة الزائدة ، وأضف 100 ميكرولتر من المادة ذات الأهمية المذابة في محلول ملحي فسيولوجي قياسي. أدخل اللوحة متعددة الآبار التي تحتوي على الخلايا المعالجة في قارئ متعدد الأوضاع. قم بإجراء تصوير في الوقت الفعلي على اللوحة من خلال الفحص المجهري بفاصل زمني تحت تكبير 20X وتصور المجال الساطع.
لتتبع الخلايا وحساب معلمات السرعات ، احصل على الإطارات الفردية باستخدام برنامج Gen5 ، واحفظ الصور في مجلد بدون مسافات في الاسم. في ImageJ ، انتقل إلى File ، متبوعا ب Import و Image Sequence. قم بتتبع الخلايا على الخلايا المفردة باستخدام المكون الإضافي للتتبع اليدوي.
قم باستيراد مجموعات البيانات من المكون الإضافي للتتبع اليدوي ImageJ إلى برنامج Chemotaxis and Migration Tool. حدد العدد المطلوب من الشرائح للتتبع. قم بمعايرة البرنامج باستخدام حجم البكسل X / Y وإعدادات الفاصل الزمني.
بعد تعيين المعلمات ، انقر فوق تطبيق الإعدادات. رسم المسارات وتصديرها كصورة. انقر فوق الزر "القيم المقاسة" لعرض النتائج ، وحفظ البيانات.
ثم انقر فوق الزر "إحصائيات" واحفظ بيانات السرعة والمباشرة لسلسلة المسار. قارن بين المعلمات المحسوبة للخلايا الضابطة مع تلك الموجودة في الخلايا الدموية المعرضة لمادة الاختبار بتركيزات متفاوتة. تم تقييم حركة الخلايا الدموية باستخدام التصوير بفاصل زمني ، حيث أظهر حركات الخلايا الفردية على مدى 10 دقائق ، مع تتبع ثابت للخلايا المرقمة عبر ثلاث نقاط زمنية من صفر وخمس و 10 دقائق.
لوحظ نوعان من الخلايا الدموية ، الخلايا المنتشرة والخلايا المستديرة الأصغر على شكل نجمة. أظهر كلا النوعين تغيرات مستمرة في الشكل بسبب نشاط الصفيحة والأرجل الكاذبة. أشارت مخططات السرعة والمباشرة إلى أنه في ظل الظروف الفسيولوجية القاعدية ، تحركت الخلايا المنتشرة بشكل أسرع مقارنة بالخلايا الأصغر.
أدى التعرض للباراسيتامول إلى تقليل حركة الخلايا المنتشرة بشكل كبير بعد 24 ساعة ، بينما لم تظهر الخلايا الصغيرة مثل هذا الانخفاض. زادت مباشرة الخلايا الصغيرة بشكل ملحوظ بعد 24 ساعة من التعرض للباراسيتامول ، بينما أظهرت الخلايا المنتشرة انخفاضا في المباشرة بعد ساعة واحدة فقط.
