使用简单搅拌容器在藻酸盐珠中的哺乳动物细胞包封

摘要

该视频和手稿描述了一种基于乳液的方法，以将哺乳动物细胞包封在0.5％至10％的藻酸盐珠中，其可以使用简单的搅拌容器以大批量生产。包封的细胞可以在体外培养或移植用于细胞治疗应用。

摘要

藻酸盐珠粒中的细胞包封已被用于体外固定化细胞培养以及体内免疫隔离。已经广泛研究胰岛包囊作为增加同种异体或异种移植物中胰岛存活的手段。藻酸盐封装通常通过喷嘴挤出和外部凝胶化来实现。使用这种方法，在喷嘴尖端形成的含细胞的藻酸盐液滴落入含有二价阳离子的溶液中，这些二价阳离子在它们扩散到液滴中时会引起离子型藻酸盐凝胶化。在喷嘴尖端形成液滴的要求限制了可以实现的体积通量和藻酸盐浓度。该视频描述了可扩展的乳化方法，以0.5％至10％的藻酸盐包封哺乳动物细胞，其中70％至90％的细胞存活。通过这种替代方法，含有细胞和碳酸钙的藻酸盐液滴在矿物油中乳化由于pH降低，导致内部钙释放和离子型藻酸盐凝胶化。目前的方法允许在乳化20分钟内生产藻酸盐珠粒。封装步骤所需的设备包括可供大多数实验室使用的简单搅拌容器。

引言

已经广泛研究了哺乳动物细胞包封作为保护移植细胞免于免疫排斥的手段¹或为固定的细胞培养^2,3,4提供三维支持。藻酸盐珠粒中的胰岛包囊已经用于逆转异种^5,6或异种7,8,9,10,11 ^{和 12}啮齿动物中的糖尿病。包封胰岛移植治疗1型糖尿病的临床前和临床试验正在进行中^13,14,15 。适用于移植应用或大规模应用通常使用体外固定化的细胞生产，基于喷嘴的珠发生器。通常，藻酸盐和细胞的混合物通过喷嘴泵送以形成落入含有二价阳离子的搅拌溶液中的液滴，导致液滴的外部凝胶化。同轴气流^{16,17 ，}喷嘴振动¹⁸ ，静电排斥¹⁹或旋转导线²⁰有助于在喷嘴尖端形成液滴。

常规珠发生器的主要缺点是其有限的生产量和溶液粘度的有限范围，这将导致足够的珠形成²¹ 。在高流速下，离开喷嘴的流体分解成小于喷嘴直径的液滴，减小了尺寸控制。多喷嘴珠发生器可用于提高生产量，但是喷嘴之间流动的均匀分布和> 0.2Pa的溶液的使用是有问题的。最后，由于所使用的喷嘴的直径在100μm和500μm之间，而15％的人胰岛可以大于200μm23，因此预计所有的喷嘴基装置都会对胰岛造成一定的损害。

在这个视频中，我们描述了通过在单个乳化步骤中形成液滴而不是逐滴地包封哺乳动物细胞的另一种方法。由于珠粒生产在简单的搅拌釜中进行，所以该方法适用于小型（〜1 mL）至大规模（10 ³ L范围）的珠粒生产，设备成本低²⁴ 。该方法允许使用具有短（ 例如 20分钟）珠生成时间的宽范围的藻酸盐粘度来生产具有高球形度的珠粒。这种方法最初由Poncelet 等人开发湖^{25,26 ，}用于固定DNA27，包括胰岛素^29的蛋白质²⁸和细菌³⁰ 。我们最近已经将这些方法适用于使用胰腺β细胞系^31,32和原发性胰腺组织³²来哺乳动物细胞的包封。

该方法的原理是在矿物油中产生由藻酸盐液滴组成的油包水乳液，随后是藻酸盐液滴的内部凝胶化（ 图1 ）。首先，将密封剂（ 例如，细胞）分散在含有细晶粒钙盐的藻酸盐溶液中，在初始工艺pH下具有低溶解度。然后将藻酸盐混合物加入到搅拌的有机相中以产生乳液，通常在a表面活性剂。在哺乳动物细胞包封的情况下，存在于血清中的成分可以作为表面活性剂。接下来，通过加入分解成水相的油溶性酸来降低pH以便溶解钙盐。矿物油/水分配系数<0.005 ^33的乙酸应预先溶解在油中，然后加入到油相中混合的乳液中，并快速分配到水相^34中 。 图2说明在酸化和内部凝胶化步骤期间发生的化学反应和扩散。最后，通过相转化回收包封的细胞，通过离心加速分离，重复洗涤步骤和过滤。然后可以采用珠和细胞取样进行这些步骤，用于质量控制分析， 体外细胞培养和/或包封细胞的移植。

图1:封装哺乳动物细胞的基于乳化的方法的示意图。首先通过在矿物油中乳化藻酸盐，细胞和CaCO ₃混合物（示意图中的步骤1和2）来生产珠粒，通过加入乙酸引发内部凝胶化（步骤3）。然后通过加入水性缓冲液将凝胶状珠粒与油分离以引发相转化（步骤4），然后离心和抽吸油（步骤5），然后过滤（步骤6）。最后，将过滤器上收集的珠子转移到细胞培养基中进行体外培养或移植。 请点击此处查看此图的较大版本。

图2:在内部凝胶化过程中发生的反应和扩散步骤。 （1）将乙酸加入到有机相中，并通过对流输送至藻酸盐液滴。 （2）乙酸分成水相。 （3）在水的存在下，酸解离并扩散到深蓝色所示的CaCO ₃颗粒。 （4）H ⁺离子与CaCO _3中的Ca ²⁺离子交换，释放Ca ²⁺离子。 （5）钙离子扩散直到遇到未反应的藻酸盐，导致藻酸盐链的离子交联。 请点击此处查看此图的较大版本。

与传统的基于喷嘴的细胞封装剂相反，具有宽的珠粒度分布由于在搅拌乳化中液滴形成的机理，该方法由该过程引起。对于应用的一个子集，这种珠粒度分布可能是有问题的。例如，更大部分的细胞可能在较小珠粒的珠粒表面暴露。如果关注营养（ 如氧气）的限制，这些限制可能会在较大的珠粒中加剧。搅拌乳化法的优点是通过改变乳化步骤中的搅拌速度可以容易地调节平均珠粒度。也可以利用宽的珠粒度分布来研究珠粒尺寸对封装的细胞性能的影响。

通过乳化和内部凝胶化的哺乳动物细胞包封是没有配备珠粒发生器的实验室的有意义的替代方案。此外，该方法还给用户减少处理时间，或生成非常低或非常高的藻酸盐浓度的珠粒ations。

下面概述的方案描述了如何将细胞包封在10.5mL在10mM 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液中制备的5％藻酸盐溶液中。藻酸盐由移植级LVM（低粘度高甘露糖醛酸含量）和MVG（中等粘度高古洛糖醛酸含量）藻酸盐的50:50混合物组成。使用终浓度为24mM的碳酸钙作为物理交联剂。轻质矿物油构成有机相，而乙酸用于酸化乳液并引发内部凝胶化。然而，藻酸盐类型和组成以及所选择的过程缓冲剂取决于期望的应用³² 。已经使用各种藻酸盐类型（参见表格材料）来制备具有该方案的珠粒。

研究方案

1.准备藻酸盐溶液，CaCO ₃悬浮液和酸化油

1. 准备过程缓冲区和介质。
   1. 制备用于使用10mM HEPES，170mM NaCl产生高浓度藻酸盐珠粒的典型工艺缓冲液。将pH调节至7.4。
   2. 使用含有10％胎牛血清（FBS），6mM谷氨酰胺，100U / mL青霉素和100mg / mL链霉素的Dulbecco's Modified Eagle培养基（DMEM）制备典型的培养基。
2. 将藻酸盐原液制备为珠粒最终所需浓度的1.17倍。
   1. 首先称重适量的藻酸盐粉末。例如，为了获得具有50:50 LVM和MVG藻酸盐的5％藻酸盐的最终浓度，通过组合0.583g LVM藻酸盐粉末和0.583g MVG藻酸盐粉末来计量总共1.17g藻酸钠。
   2. 将20 mL过程缓冲区放入autoc在搅拌盘上搅拌约200转/分钟。逐渐向溶液中加入藻酸钠粉末。
   3. 将溶液以低速搅拌过夜。如有必要，将烧瓶固定到搅拌板上。
   4. 如果溶液不完全溶解，将瓶子固定在旋转混合器上，并在37℃下继续混合24小时。
   5. 通过在小于半满的容器中将溶液高压灭菌30分钟来灭藻藻酸盐溶液。在取出溶液之前让温度降至60°C以下。
   6. 如果需要，通过在高压灭菌之后不久将藻酸盐溶液过滤至达到室温，同时粘度保持足够低的情况下除去颗粒。
3. 以最终所需浓度的21倍制备碳酸钙悬浮液用于内部凝胶化。
   1. 称量CaCO ₃粉末。例如，广告d 1g CaCO ₃至20mL工艺缓冲液以获得24mM CaCO ₃作为最终胶凝剂浓度。
   2. 将CaCO ₃悬浮液高压灭菌30分钟。
      注意:由于碳酸氢二氢二氧化碳的平衡，CaCO ₃浓度会随时间而变化。避免使用相同的库存CaCO ₃悬浮液进行10多次封装程序。
4. 高压灭菌用于乳化过程的搅拌釜。在使用前，清除旋转瓶中剩余的冷凝水痕迹。
5. 在乳化过程之前，准备酸化油。溶解44μL醋酸每11 mL矿物油放置在一个50mL锥形管中。
   注意:一个常见的错误是醋酸的不完全溶解。避免吸取少量乙酸，并确保通过反复涡旋将乙酸完全溶解在油中。
   注意:乙酸是一种有毒的 d挥发酸。在通风橱下处理此试剂，并将乙酸/油溶液保持在密闭容器中直到乳化步骤。请参阅此试剂的MSDS信息了解更多信息。
6. 在进行细胞包封之前，让所有的溶液达到室温。

2.通过乳化和内部凝胶化产生藻酸盐珠

1. 将10 mL轻质矿物油放入旋转式烧瓶中，并以低转速开始搅拌（ 如本影像中使用的旋转烧瓶为250 rpm）。
2. 如果用于该过程的细胞来自贴壁培养物，则应用胰蛋白酶来悬浮细胞。通过加入含FBS的培养基或胰蛋白酶抑制剂结束反应，并收集样品用于细胞计数。
   1. 使用血细胞计数器或自动细胞计数器确定台盼蓝染色后的细胞浓度和活力，如前所述ass ="xref"> 32。
3. 以300×g离心细胞7分钟，并在所需培养基中洗涤一次以进行细胞固定。确保该培养基含有乳化剂，如FBS或牛血清白蛋白（BSA）。例如，使用含10％FBS的DMEM。
4. 将细胞沉淀重新悬浮在相同的培养基中，以获得珠粒中所需的最终浓度的10.5倍。
5. 加入1.1 mL 10.5倍浓缩的细胞储备液至9.9 mL藻酸盐溶液。然后，加入550μLCaCO ₃悬浮液，并用无菌刮刀搅拌混合，以确保CaCO ₃均匀分布。
6. 使用注射器立即将10.5mL的藻酸盐，细胞和CaCO ₃混合物转移到搅拌油中。
   注意:对于高粘度溶液，可以缓慢吸出并喷射混合物以避免气泡。在一些情况下，优选在将混合物加入烧瓶中以避免搅拌停止藻酸盐夹带在叶轮轴上。
7. 在将藻酸盐，细胞和CaCO ₃混合物加入到油中之后，立即增加搅拌速度。
   注意:对于本文使用的5％LVM:MVG藻酸盐，应用1025rpm的转速以产生适合于体外培养的约900μm直径的珠粒。如先前的出版物^25,32所述，较高的转速和较低的藻酸盐浓度将导致更低的平均珠粒直径。叶轮和容器几何形状的微小变化以及藻酸盐性质可以极大地影响平均珠径。对于容器结构或藻酸盐批次的每个变化，应该产生一个将表面积平均珠粒直径与转速相关的标准曲线³² 。
8. 启动计时器并将藻酸盐乳化12分钟。
9. 加入10 mL t他用油和乙酸溶液酸化乳液，溶解CaCO ₃ ，从而将藻酸盐物理交联成胶凝珠。允许该酸化步骤8分钟。

珠回收

1. 将搅拌速度降至400 rpm。加入40 mL与10％培养基混合的工艺缓冲液以增加pH并引起相转化。
2. 1分钟后停止搅拌，并将混合物转移到50mL离心管中。用额外的20 mL培养基冲洗旋转瓶，并将其加入管中。在吸出油相之前，尽可能多地从旋转瓶中吸出水相，以尽量减少与油相的珠珠接触。
   注意:在此步骤和使用大口径移液管（ 例如 25毫升移液管），以避免损坏珠子。对于较小的体积，珠悬浮液也可以用切割移液管吸头进行操作。要获得这样的提示，用剪刀剪切移液管尖端的末端ile佩戴眼睛保护。
3. 以630×g离心管3分钟以加速珠沉淀和相分离。
4. 通过用巴斯德吸管吸出去除油和多余的水溶液。
5. 用介质洗涤珠子至少一次。过滤40μm尼龙细胞过滤器上的珠粒悬浮液，并从过滤器下方吸出与珠粒相关的过量液体。使用无菌刮铲将珠子转移到已知体积的培养基中。
   注意:根据目标最小珠粒直径，此步骤可使用较小或较大孔径的过滤器。然而，推荐重力过滤，而不是通过亚微米孔径过滤器进行压力驱动过滤，以避免损坏珠粒。
6. 通过体积位移（加入珠子后的体积减去加入珠粒之前的体积）测量珠体积并填充培养基以获得所需的珠粒:总体积比（通常为1:5）或1mL珠粒4 mL培养基。从这一点上，始终使用大口径移液器，以避免损坏珠子。
7. 将包封的细胞转移到T型瓶中用于体外培养或移植实验。

4.质量控制与应用

注意:为了确保包封的细胞和珠粒质量，应该量化该过程之后的珠粒度分布和细胞存活。通常进行反转凝胶以从珠内回收细胞用于进一步分析。

1. 为了评估珠粒尺寸分布，用甲苯胺蓝-O染色珠粒。
   1. 将0.5 mL珠粒放入含有10％完全培养基的4 mL过程缓冲液中。
   2. 加入500μL在工艺缓冲液中制备的1 g / L甲苯胺蓝溶液。
   3. 在旋转振荡器上的锥形管中以50rpm孵育60分钟。
   4. 加入含有10％完全培养基的5 mL过程缓冲液将珠粒和溶液转移到培养皿中，并在低倍数显微镜上或使用手持式数码相机拍摄图像。如果需要，在用手持相机拍摄图像之前，将培养皿放在灯箱上，以增强对比度，避免阴影。
   5. 执行图像分析以如前所述³²量化珠粒度分布，例如使用图像分析免费软件³⁶ 。
2. 为了定性评估细胞存活，使用同源二聚体染色细胞以鉴定死细胞和钙黄绿素AM以鉴定活细胞。
   1. 将1体积的珠添加到含有10％完全培养基的4体积的过程缓冲液中。
   2. 加入适量的钙黄绿素AM和乙二胺二聚体储备液，分别得到4μM和2μM浓度。通过向一些珠粒样品中添加一种试剂来产生单一染色剂对照。
   3. 在冰上孵育珠子20分钟。
   4. 将溶液放置在载玻片和盖玻片之间，使用间隔物如O形环，以避免压缩珠粒。
   5. 继续进行荧光显微镜检查。使用单一污渍控制来评估荧光渗透。根据与钙黄绿素AM（494/517 nm）和与DNA结合的乙炔同二聚体（528/617 nm）相关的激发/发射波长，选择合适的荧光滤光片。
3. 为了从珠中回收细胞用于进一步分析，使用柠檬酸盐或另一种螯合溶液使藻酸盐脱胶。
   1. 在pH 7.4下制备含有55mM柠檬酸盐，10mM HEPES和95mM NaCl的去脂溶液。
   2. 将该溶液与10％培养基混合，然后向9mL混合物中加入1mL藻酸盐珠粒。
   3. 将冰珠上的冰珠75g搅拌20分钟。
      注意:细胞现在可用于分析或从去角质的藻酸盐溶液中去除通过离心离心。例如，消毒后的细胞活力可以通过台盼蓝染色定量。或者，可将细胞离心并洗涤，随后进行mRNA，DNA和/或蛋白质取样和分析。

结果

在乳化和内部凝胶化过程结束时，应回收与初始藻酸盐和细胞混合物体积相似的珠粒体积。珠子应该是高度球形的，几乎没有缺陷（ 图3 ）。珠子应该足够坚固，以通过大口径移液管来承受移液。在高藻酸盐浓度下，可以在珠粒中观察到包封的油或气滴。这可能是由于在乳化步骤（油/水/油双重乳液）期间在藻酸盐液滴中捕获油。在我们手中，?...

讨论

在内部凝胶化反应期间的各种步骤（ 图2中所示 ）可以限制整个动力学。对于大于〜2.5μm的碳酸钙颗粒，碳酸盐溶解速率已被证明是速率限制^26,44 。导致内部钙释放的酸化步骤也被证明是影响细胞存活的关键过程变量³² 。因此，导致内部凝胶化的条件对于珠粒质量以及细胞存活是至关重要的。根据珠粒的最终应用，可以选择不同的最佳...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and consumables
LVM alginate (transplantation-grade)	Novamatrix	Non-applicable	Referred to as "alginate #1" in the results.
MVG alginate (transplantation-grade)	Novamatrix	Non-applicable	Referred to as "alginate #2" in the results.
Alginate (cell culture-grade)	Sigma	A0682 (low viscosity) or A2033 (medium viscosity)	A2033 is referred to as "alginate #3" in the results.
DMEM	Life Technologies	11995-065
Fetal bovine serum, characterized, Canadian origin	Thermo Fisher Scientific	SH3039603
Glutamine	Life Technologies	25030
Penicillin and streptomycin	Sigma	P4333-100ML
HEPES, cell culture tested	Sigma	H4034-100G
NaCl	Thermo Fisher Scientific	S271-1
Fine-grain CaCO3	Avantor Materials	1301-01	After preparing the CaCO3 suspension, sonicate and use within one month.
Light mineral oil	Thermo Fisher Scientific	O121-4	Sterile filter through a 0.22 μm pore size membrane prior to use.
Glacial acetic acid	Thermo Fisher Scientific	A38-500	Handle with caution: refer to MSDS.
Sterile spatulas	Sigma	CLS3004-100EA
Sterile nylon cell strainers, 40 µm	Thermo Fisher Scientific	08-771-1
Serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL)	Sarstedt	86.1252.001, 86.1253.001, 86.1254.001 and 86.1685.001
Pasteur pipettes	VWR	14673-043
Toluidine Blue-O	Sigma	T3260
Equipment
100 mL microcarrier spinner flasks	Bellco	1965-00100	The impeller configuration with recent models may not be suitable for adequate emulsification. A blade able to sweep the oil down to 0.5 cm from the bottom of the flask can be custom-made from a Teflon sheet.
Magnetic stir plate with adjustable speed	Bellco	7760-06005	The rotation speed should be calibrated (e.g. using a tachometer) prior to use.
Cell counter	Innovatis	Cedex AS20	This system is now sold by Roche. This automated cell counter can also be replaced by manual cell enumeration after Trypan blue staining using a hemocytometer.
LED light box	Artograph	LightPad® PRO	This item can be replaced by other types of illuminators.
Handheld camera	Canon	PowerShot A590 IS	A variety of handheld cameras can be used to capture toluidine blue-o stained bead images. A ruler should be placed next to the Petri dish containing the beads prior to acquiring images.
Fluorescence microscope with phase contrast and adequate fluorescence filters	Olympus	IX81	Several microscopy systems were used to image the beads. The results shown here were obtained with an IX81 microscope equipped with GFP and TRITC fluorescence filters. To capture entire beads, 4X to 20X objectives were used depending on the agitation rate. Live/dead staining images were typically captured with 20X to 40X objectives.
Image aquisition software	Molecular Devices	Metamorph	A variety of image acquisition software can be used to acquire phase contrast and fluorescence images.
Image analysis freeware	CellProfiler	Non-applicable	A variety of image analysis software can be used to identify beads as objects and analyze bead size (e.g. ImageJ).