JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этом видео и рукописи описывается метод на основе эмульсии для инкапсуляции клеток млекопитающих в 0,5-10% альгинатных гранул, которые могут быть получены крупными партиями с использованием простого сосуда с мешалкой. Инкапсулированные клетки можно культивировать in vitro или трансплантировать для применения в клеточной терапии.

Аннотация

Инкапсулирование клеток в альгинатных шариках использовалось для иммобилизованной клеточной культуры in vitro, а также для иммуноизоляции in vivo . Инкапсуляция островков поджелудочной железы широко изучалась как средство повышения выживаемости островков при аллогенных или ксеногенных трансплантатах. Альгинатная инкапсуляция обычно достигается путем экструзии сопел и внешнего гелеобразования. Используя этот метод, клеточные альгинатные капли, сформированные на кончике сопел, попадают в раствор, содержащий двухвалентные катионы, которые вызывают ионотропное гелеобразование альгината, когда они диффундируют в капли. Требование образования капель на наконечнике сопла ограничивает объемную пропускную способность и концентрацию альгината, которая может быть достигнута. В этом видео описывается масштабируемый метод эмульгирования для инкапсуляции клеток млекопитающих в 0,5-10% альгинат с выживаемостью клеток от 70 до 90%. В соответствии с этим альтернативным методом капли альгината, содержащие клетки и карбонат кальция, эмульгируют в минеральном масле,Пониженное снижением рН, приводящим к внутреннему высвобождению кальция и ионотропному альгинату. Текущий метод позволяет получать альгинатные гранулы в течение 20 мин после эмульгирования. Оборудование, необходимое для этапа инкапсуляции, состоит из простых сосудов с мешалкой, доступных для большинства лабораторий.

Введение

Инкапсуляция клеток млекопитающих широко изучалась как средство защиты трансплантированных клеток от иммунного отторжения 1 или для обеспечения трехмерной поддержки иммобилизованной клеточной культуры 2 , 3 , 4 . Инкапсуляция поджелудочной железы в альгинатных шариках использовалась для лечения диабета у аллогенных 5 , 6 или ксеногенных 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 грызунов. Доклинические и клинические испытания инкапсулированной трансплантации трансплантата поджелудочной железы для лечения диабета 1 типа продолжаются 13 , 14 , 15 . Для применений трансплантации или более крупныхE in vitro иммобилизованных клеточных производств, обычно используются генераторы шариковых оснований. Как правило, смесь альгината и клеток прокачивается через сопло для образования капелек, которые попадают в перемешиваемый раствор, содержащий двухвалентные катионы, что приводит к внешнему гелеобразованию капель. Коаксиальный поток газа 16 , 17 , вибрация 18 сопел, электростатическое отталкивание 19 или вращающиеся провода 20 способствуют образованию капель на наконечнике сопла.

Основными недостатками традиционных генераторов шариков являются их ограниченная пропускная способность и ограниченный диапазон вязкости раствора, что приведет к адекватному формированию шарика 21 . При высоких расходах текучая среда, выходящая из сопла, распадается на капельки, меньшие диаметра сопла, уменьшая размерный контроль. Для увеличения пропускной способности можно использовать генераторы с несколькими соплами, ноРавномерное распределение потока между соплами и использование решений> 0,2 Pas проблематично 22 . Наконец, ожидается, что все устройства на основе сопел принесут некоторый ущерб островкам, так как диаметр используемых сопел составляет от 100 до 500 мкм, тогда как ~ 15% островков человека может быть больше 200 мкм 23 .

В этом видео мы описываем альтернативный метод инкапсуляции клеток млекопитающих путем образования капель на одном этапе эмульгирования вместо капли по капле. Поскольку производство шариков осуществляется в простой мешалке, этот метод подходит для небольших (~ 1 мл) и крупномасштабных (10 3 L диапазон) производства шариков с низкой стоимостью оборудования 24 . Этот метод позволяет получать шарики с высокой сферичностью с использованием широкого диапазона вязкостей альгината с короткими ( например, 20-минутными) временами получения шариков. Этот метод был первоначально разработан Poncelet et aл. 25 , 26 и используется для иммобилизации ДНК 27 , белков 28, включая инсулин 29 , и бактерий 30 . Недавно мы адаптировали эти методы к инкапсулированию клеток млекопитающих с использованием линий поджелудочной железы бета-клеток 31 , 32 и первичной ткани поджелудочной железы 32 .

Принцип метода заключается в создании эмульсии вода-в-масле, состоящей из капель альгината в минеральном масле, с последующим внутренним гелеобразованием альгинатных капель ( рис. 1 ). Сначала инкапсулянт ( например, клетки) диспергируют в растворе альгината, содержащем мелкозернистую кальциевую соль с низкой растворимостью при начальном рН процесса. Затем альгинатную смесь добавляют к перемешиваемой органической фазе для создания эмульсии, обычно в присутствииповерхностно-активное вещество. В случае инкапсуляции клеток млекопитающих компоненты, присутствующие в сыворотке, могут действовать как поверхностно-активные вещества. Затем рН снижают, чтобы солюбилизировать соль кальция, добавляя маслорастворимую кислоту, которая разделяется на водную фазу. Уксусная кислота с коэффициентом распределения минерального масла / воды <0,005 33 должна быть предварительно растворена в масле, затем добавлена ​​в эмульсию, где она смешивается в масляной фазе и быстро перегоняется в водную фазу 34 . На рисунке 2 показаны химические реакции и диффузия, которые происходят во время стадии подкисления и внутреннего гелеобразования. Наконец, инкапсулированные клетки извлекают путем инверсии фазы, фазового разделения ускоряют путем центрифугирования, повторных этапов промывки и фильтрации. Затем эти этапы могут быть выполнены с помощью отбора проб из бусинок и клеток для анализа контроля качества, культуры клеток in vitro и / или трансплантации инкапсулированных клеток.

figure-introduction-5448
Рисунок 1: Схема процесса эмульгирования для инкапсулирования клеток млекопитающих. Бусины сначала получают путем эмульгирования смеси альгината, ячейки и СаСО 3 в минеральном масле (этапы 1 и 2 на схеме), инициируя внутреннее гелеобразование путем добавления уксусной кислоты (этап 3). Затем гелеобразные гранулы отделяют от масла путем добавления водного буфера для инициирования инверсии фазы (стадия 4) с последующим центрифугированием и масляной аспирированием (стадия 5), а затем фильтрацией (этап 6). Наконец, гранулы, собранные на фильтре, переносят в культуральную среду для культуры in vitro или для трансплантации. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-introduction-6426
Рисунок 2: Реакции и стадии диффузии, возникающие во время внутреннего гелеобразования. (1) Уксусную кислоту добавляют к органической фазе и транспортируют к капелькам альгината конвекцией. (2) Уксусная кислота переходит в водную фазу. (3) В присутствии воды кислота диссоциирует и диффундирует для достижения зерен СаСО 3, изображенных в темно-синем. (4) Ионы H + обмениваются с ионами Ca 2+ в CaCO 3 , высвобождая ионы Ca 2+ . (5) Ионы кальция диффундируют до тех пор, пока не столкнутся с непрореагировавшим альгинатом, что приведет к ионотропному сшиванию альгинатных цепей. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

В отличие от обычных сотовых инкапсуляторов на основе сопел широкое распределение размеров бусинок является expeИз-за механизма образования капель в перемешиваемой эмульсификации. Для подмножества приложений это распределение размера шарика может быть проблематичным. Например, большая часть клеток может быть выставлена ​​на поверхности борта в меньших шариках. Если проблемы с питательными веществами ( например, кислородом) вызывают беспокойство, эти ограничения могут усугубляться в больших шариках. Преимущество метода перемешанной эмульгирования состоит в том, что средний размер шарика может быть легко отрегулирован путем изменения скорости перемешивания на стадии эмульгирования. Широкое распределение размера шарика можно также использовать для изучения влияния размера шарика на производительность инкапсулированных ячеек.

Инкапсуляция клеток млекопитающих путем эмульгирования и внутреннего гелеобразования является интересной альтернативой для лабораторий, которые не оснащены генератором шариков. Кроме того, этот метод дает пользователям возможность сократить время обработки или генерировать бусины с очень низкой или очень высокой концентрацией альгинатаations.

В приведенном ниже протоколе описывается, как инкапсулировать клетки в 10,5 мл 5% раствора альгината, полученного в буфере 10 мМ 4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфоновой кислоты (HEPES). Альгинат состоит из смеси 50:50 трансплантогенного LVM (содержание малнуроновой кислоты с низкой вязкостью) и альгината MVG (средняя вязкость с высоким содержанием гулуроновой кислоты). В качестве физического сшивающего агента используют карбонат кальция с конечной концентрацией 24 мМ. Легкое минеральное масло представляет собой органическую фазу, в то время как уксусная кислота используется для подкисления эмульсии и инициирования внутреннего гелеобразования. Однако тип и состав альгината, а также выбранный буфер процесса зависят от желаемого применения 32 . Для производства гранул с этим протоколом использовались различные типы альгинатов (см. Таблицу материалов).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Подготовьте раствор альгината, суспензию CaCO 3 и кислотное масло

  1. Подготовьте буфер процесса и среду.
    1. Подготовьте типичный буфер процесса, используемый для получения гранул альгината высокой концентрации с использованием 10 мМ HEPES, 170 мМ NaCl. Отрегулируйте pH до 7,4.
    2. Подготовьте типичную культуральную среду с использованием модифицированной среды Dulbecco's Eagle Medium (DMEM), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 6 мМ глутамина, 100 ед. / Мл пенициллина и 100 мг / мл стрептомицина.
  2. Подготовьте раствор альгината в 1,17 раза конечной желаемой концентрацией в шариках.
    1. Сначала взвешивают соответствующее количество порошка альгината. Например, чтобы получить конечную концентрацию 5% альгината с 50:50 LVM и альгинатом MVG, взвесьте всего 1,17 г альгината натрия, объединив 0,583 г порошка альгината LVM и 0,583 г порошка альгината MVG.
    2. Поместите 20 мл технологического буфера в автокПластичной стеклянной банки на магнитной мешалке и перемешивать при ~ 200 об / мин. Постепенно добавляйте порошок альгината натрия к раствору.
    3. Оставьте раствор перемешивать в течение ночи с низкой скоростью. При необходимости прикрепите колбу к перемешивающей пластине.
    4. Если раствор полностью не растворяется, закрепите бутылку на ротационном смесителе и продолжайте перемешивание при 37 ° C еще 24 часа.
    5. Стерилизуют раствор альгината путем автоклавирования раствора в течение 30 мин в сосуде, который составляет менее половины. Дайте температуре до 60 ° C до получения раствора.
    6. При необходимости удалите частицы путем фильтрации раствора альгината вскоре после автоклавирования до достижения комнатной температуры, а вязкость остается достаточно низкой.
  3. Подготовьте суспензию карбоната кальция в 21 кратной конечной желаемой концентрации для внутреннего гелеобразования.
    1. Взвесьте порошок CaCO 3 . Например, объявлениеD 1 г СаСО 3-20 мл технологического буфера для получения 24 мМ CaCO 3 в качестве конечной концентрации гелеобразующего агента.
    2. Автоклав суспензии CaCO 3 в течение 30 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Концентрация CaCO 3 будет меняться со временем из-за равновесия бикарбоната - СО 2 . Избегайте использования той же суспензии CaCO 3, что и для более чем 10 процедур инкапсуляции.
  4. Автоклавируйте сосуд с мешалкой, используемый для процесса эмульгирования. Перед использованием удалите все остатки конденсированной воды, оставшиеся в колбе для прядильной машины.
  5. Непосредственно перед процессом эмульгирования подготовьте подкисленное масло. Растворить 44 мкл уксусной кислоты на 11 мл минерального масла, помещенного в 50 мл коническую трубку.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Общей ошибкой является неполное растворение уксусной кислоты. Избегайте пипетирования небольших количеств уксусной кислоты и убедитесь, что уксусная кислота полностью растворяется в масле путем повторного вортекса.
    ОСТОРОЖНО: уксусная кислота является токсичной D летучей кислоты. Образуйте этот реагент под вытяжной шкаф и держите раствор уксусной кислоты / масла в закрытом контейнере до стадии эмульгирования. Для получения дополнительной информации см. Информацию MSDS об этом реагенте.
  6. Позвольте всем растворам достичь комнатной температуры, прежде чем приступать к клеточной инкапсуляции.

2. Генерация альгинатного бисера путем эмульгирования и внутреннего гелеобразования

  1. Поместите 10 мл легкого минерального масла в колбу с вращателем и начните перемешивание с низкой скоростью вращения ( например, 250 об / мин для колбы с вращателем, используемой в этом видео).
  2. Если клетки, используемые для этого процесса, являются адгезивными культурами, применяют трипсин для суспендирования клеток. Завершите реакцию, добавив FBS-содержащую среду или ингибитор трипсина и соберите образец для перечисления клеток.
    1. Определите концентрацию и жизнеспособность клеток после окрашивания трипановым синим, используя гемоцитометр или автоматический счетчик клеток, как описано вышеAss = "xref"> 32.
  3. Центрифугируйте клетки в течение 7 мин при 300 × g и промывайте их один раз в желаемой среде для иммобилизации клеток. Убедитесь, что эта среда содержит эмульгаторы, такие как FBS или бычий сывороточный альбумин (BSA). Например, используйте DMEM, содержащий 10% FBS.
  4. Повторно суспендируйте клеточный осадок в той же среде, чтобы получить в 10,5 раза желаемую конечную концентрацию в гранулах.
  5. Добавьте 1,1 мл 10,5-кратного концентрированного клеточного фонда в 9,9 мл раствора альгината. Затем добавляют 550 мкл суспензии CaCO 3 и перемешивают при перемешивании стерильным шпателем для обеспечения равномерного распределения CaCO 3 .
  6. Немедленно переносите 10,5 мл альгинатной, клеточной и CaCO 3 смеси в перемешивающее масло с помощью шприца.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Для высоковязких растворов аспирируйте и выбрасывайте смесь очень медленно, чтобы избежать пузырьков воздуха. В некоторых случаях предпочтительно останавливать перемешивание, добавляя смесь в колбу, чтобы избежатьЗахвата альгината на вал рабочего колеса.
  7. Сразу после добавления смеси альгината, клетки и СаСО 3 в масло увеличить скорость перемешивания.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Для 5% альбумина LVM: MVG, используемого здесь, применяли скорость вращения 1025 об / мин для получения гранул диаметром приблизительно 900 мкм, подходящих для культуры in vitro 35 . Более высокие скорости вращения и более низкие концентрации альгината приведут к более низким средним диаметрам шариков, как описано в предыдущих публикациях 25 , 32 . Небольшие изменения в геометрии рабочего колеса и сосуда, а также свойства альгината могут сильно повлиять на средний диаметр шарика. Для каждого изменения конфигурации сосуда или партии альгината должна генерироваться стандартная кривая, связывающая средний диаметр шарика поверхности с частотой вращения 32 .
  8. Запустите таймер и эмульгируйте альгинат в течение 12 минут.
  9. Добавить 10 мл тРаствор масла и уксусной кислоты для подкисления эмульсии, растворения CaCO 3 и, следовательно, физическое сшивание альгината в гелеобразные гранулы. Разрешить 8 минут для этой стадии подкисления.

3. Восстановление бисера

  1. Уменьшите скорость перемешивания до 400 об / мин. Добавить 40 мл технологического буфера, смешанного с 10% -ной средой, для повышения рН и вызвать инверсию фазы.
  2. Остановите перемешивание через 1 минуту и ​​перенесите смесь в 50 мл центрифужные пробирки. Промойте вращающуюся колбу дополнительным 20 мл средой и добавьте ее в пробирку. Аспирируйте как можно больше водной фазы из колбы с прядильной машиной перед аспирации масляной фазы, чтобы минимизировать контакт шариков с масляной фазой.
    ПРИМЕЧАНИЕ. На этом шаге используйте пипетку большого диаметра ( например, 25 мл пипетки) и с этого момента, чтобы избежать повреждения гранул. Для меньших объемов подвеску шариков можно также манипулировать срезанными наконечниками пипеток. Чтобы получить такие наконечники, отрежьте конец наконечника пипетки ножницами whIle с защитой глаз.
  3. Центрифугируйте пробирки в течение 3 мин при 630 xg для ускорения осаждения шариков и разделения фаз.
  4. Удалите масло и избыток водного раствора путем аспирации с помощью пипетки Пастера.
  5. Вымойте бусины хотя бы один раз со средой. Отфильтруйте суспензию шариков на 40 мкм нейлоновых клеточных фильтрах и избыточную жидкость для аспирации, связанную с шариками, ниже фильтра. Перенесите гранулы в известный объем среды, используя стерильный шпатель.
    ПРИМЕЧАНИЕ. На этом этапе можно использовать фильтры меньшего размера или большего размера пор, в зависимости от минимального диаметра шариков. Тем не менее, рекомендуется фильтрация под действием силы тяжести, а не фильтрация под давлением через фильтры с субмикронным размером пор, чтобы избежать повреждения гранул.
  6. Измерьте объем борта по объемному смещению (объем после добавления шариков, минус объем перед добавлением шариков) и долейте материал до получения желаемого шарика: общее объемное соотношение, которое обычно составляет 1: 5 или 1 мл гранул в4 мл среды. С этого момента всегда используйте пипетки большого диаметра, чтобы не повредить бусины.
  7. Перенесите инкапсулированные клетки в Т-колбы для культивирования in vitro или экспериментов по трансплантации.

4. Контроль качества и применение

ПРИМЕЧАНИЕ. Для обеспечения качества капсулированных ячеек и шариков необходимо определить количественное распределение гранулы и выживаемость клеток после процесса. Обычно реверсируют гель для извлечения клеток из бусинок для дальнейшего анализа.

  1. Чтобы оценить распределение размеров бусинок, окрашивайте бусины толуидиновым синим-O.
    1. Поместите 0,5 мл гранулы в 4 мл технологический буфер, содержащий 10% полной среды.
    2. Добавить 500 мкл 1 г / л толуидинового синего раствора, приготовленного в технологическом буфере.
    3. Инкубируйте в течение 60 мин в конической трубке на роторном шейкере со скоростью 50 об / мин.
    4. Добавить 5 мл технологический буфер, содержащий 10% полной среды и сразуIately передавайте бусины и раствор в чашку Петри и приобретайте изображения на микроскопе с малым увеличением или с помощью ручной цифровой камеры. Если необходимо, поместите чашку Петри на световую коробку, прежде чем приобретать изображения с помощью ручной камеры, чтобы улучшить контраст и избежать теней.
    5. Выполните анализ изображений, чтобы количественно распределить размер бисера, как описано ранее 32 , например, используя бесплатное программное обеспечение для анализа изображений 36 .
  2. Чтобы качественно оценить выживаемость клеток, окрашивайте клетки с помощью гомодимера этидия, чтобы идентифицировать мертвые клетки и кальцеин AM для идентификации живых клеток.
    1. Добавьте 1 объем шариков в 4 объема технологического буфера, содержащего 10% полной среды.
    2. Добавьте соответствующее количество растворов кальцеина АМ и этидиум-гомодимера для получения 4 мкМ и 2 мкМ концентраций, соответственно. Генерируйте однократное управление пятнами, добавляя только один из реагентов к некоторым образцам борта.
    3. Инкубируйте шарики на льду в течение 20 мин.
    4. Поместите раствор между слайдом и покровным слоем с помощью прокладки, такой как уплотнительное кольцо, чтобы избежать сжатия шариков.
    5. Перейдите к флуоресцентной микроскопии. Используйте одиночные контрольные пятна для оценки пропускания флуоресценции. Выберите подходящие флуоресцентные фильтры на основе длин волн возбуждения / излучения, связанных с кальцеином AM (494/517 нм) и гомодимером этидия, связанным с ДНК (528/617 нм).
  3. Чтобы восстановить клетки из бусинок для дальнейшего анализа, дегельминтируйте альгинат, используя цитрат или другой хелатный раствор.
    1. Подготовьте раствор для дегельмирования, содержащий 55 мМ цитрата, 10 мМ HEPES и 95 мМ NaCl при рН 7,4.
    2. Смешайте этот раствор с 10% средой и затем добавьте 1 мл альгината в 9 мл смеси.
    3. Выровняйте шарики на льду с перемешиванием 75 об / мин в течение 20 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Клетки теперь могут быть использованы для анализа или удалены из растворенного альгинатного раствораИоном путем центрифугирования. Например, жизнеспособность клеток после дегельминтизации может быть определена количественно окрашиванием Trypan Blue. Альтернативно, клетки можно центрифугировать и промывать, а затем проводить анализ и анализ мРНК, ДНК и / или белка.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

В конце процесса эмульгирования и внутреннего гелеобразования необходимо извлечь объем борта, аналогичный исходному альгинату и объемной смеси клеток. Бусины должны быть очень сферическими с небольшим количеством дефектов ( рис. 3 ). Бусины должны ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Различные этапы (изображенные на фиг. 2 ) во время реакции внутреннего гелеобразования могут ограничивать общую кинетику. Было показано, что для зерен карбоната кальция, превышающих ~ 2,5 мкм, скорость растворения карбоната является ограничивающей скорость 26 ,...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Джил Осборн за ее наземную работу над процессом эмульгирования и Лорен Уилкинсон за техническую поддержку. Мы благодарим д-ра Игоря Лачика, доктора Тимоти Дж. Киффера и д-ра Джеймса Д. Джонсона за их вклад и сотрудничество. Мы благодарим Diabète Québec, JDRF, ThéCell, Центр исследований и исследований (CQMF), Научный совет по естественным наукам и инженерным исследованиям (NSERC), Центр трансплантации островных островков и регенерации бета-клеток, Канадскую сеть стволовых клеток, Фонд Майкла Смита по исследованиям в области здравоохранения, Le Fonds québécois de la recherche sur la nature et les technologies и COST 865 для финансовой поддержки.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents and consumables
LVM alginate (transplantation-grade)NovamatrixNon-applicableReferred to as "alginate #1" in the results.
MVG alginate (transplantation-grade)NovamatrixNon-applicableReferred to as "alginate #2" in the results.
Alginate (cell culture-grade)SigmaA0682 (low viscosity) or A2033 (medium viscosity)A2033 is referred to as "alginate #3" in the results.
DMEMLife Technologies11995-065
Fetal bovine serum, characterized, Canadian originThermo Fisher ScientificSH3039603
GlutamineLife Technologies25030
Penicillin and streptomycinSigmaP4333-100ML
HEPES, cell culture testedSigmaH4034-100G
NaClThermo Fisher ScientificS271-1
Fine-grain CaCO3Avantor Materials1301-01After preparing the CaCO3 suspension, sonicate and use within one month.
Light mineral oilThermo Fisher ScientificO121-4Sterile filter through a 0.22 μm pore size membrane prior to use.
Glacial acetic acidThermo Fisher ScientificA38-500Handle with caution: refer to MSDS.
Sterile spatulasSigmaCLS3004-100EA
Sterile nylon cell strainers, 40 µmThermo Fisher Scientific08-771-1
Serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL)Sarstedt86.1252.001, 86.1253.001, 86.1254.001 and 86.1685.001
Pasteur pipettesVWR14673-043
Toluidine Blue-OSigmaT3260
Equipment
100 mL microcarrier spinner flasksBellco1965-00100The impeller configuration with recent models may not be suitable for adequate emulsification. A blade able to sweep the oil down to 0.5 cm from the bottom of the flask can be custom-made from a Teflon sheet.
Magnetic stir plate with adjustable speedBellco7760-06005The rotation speed should be calibrated (e.g. using a tachometer) prior to use.
Cell counterInnovatisCedex AS20This system is now sold by Roche. This automated cell counter can also be replaced by manual cell enumeration after Trypan blue staining using a hemocytometer.
LED light boxArtographLightPad® PROThis item can be replaced by other types of illuminators.
Handheld cameraCanonPowerShot A590 ISA variety of handheld cameras can be used to capture toluidine blue-o stained bead images. A ruler should be placed next to the Petri dish containing the beads prior to acquiring images.
Fluorescence microscope with phase contrast and adequate fluorescence filtersOlympusIX81Several microscopy systems were used to image the beads. The results shown here were obtained with an IX81 microscope equipped with GFP and TRITC fluorescence filters. To capture entire beads, 4X to 20X objectives were used depending on the agitation rate. Live/dead staining images were typically captured with 20X to 40X objectives.
Image aquisition softwareMolecular DevicesMetamorphA variety of image acquisition software can be used to acquire phase contrast and fluorescence images.
Image analysis freewareCellProfilerNon-applicableA variety of image analysis software can be used to identify beads as objects and analyze bead size (e.g. ImageJ).

Ссылки

  1. Scharp, D. W., Marchetti, P. Encapsulated islets for diabetes therapy: history, current progress, and critical issues requiring solution. Adv Drug Deliv Rev. 67-68, 35-73 (2014).
  2. Chayosumrit, M., Tuch, B., Sidhu, K. Alginate microcapsule for propagation and directed differentiation of hESCs to definitive endoderm. Biomaterials. 31 (3), 505-514 (2010).
  3. Sidhu, K., Kim, J., Chayosumrit, M., Dean, S., Sachdev, P. Alginate microcapsule as a 3D platform for propagation and differentiation of human embryonic stem cells (hESC) to different lineages. J Vis Exp. (61), (2012).
  4. Tostoes, R. M., et al. Perfusion of 3D encapsulated hepatocytes--a synergistic effect enhancing long-term functionality in bioreactors. Biotechnol Bioeng. 108 (1), 41-49 (2011).
  5. Duvivier-Kali, V. F., Omer, A., Parent, R. J., O'Neil, J. J., Weir, G. C. Complete protection of islets against allorejection and autoimmunity by a simple barium-alginate membrane. Diabetes. 50 (8), 1698-1705 (2001).
  6. Omer, A., et al. Long-term normoglycemia in rats receiving transplants with encapsulated islets. Transplantation. 79 (1), 52-58 (2005).
  7. Rayat, G. R., Rajotte, R. V., Ao, Z., Korbutt, G. S. Microencapsulation of neonatal porcine islets: protection from human antibody/complement-mediated cytolysis in vitro and long-term reversal of diabetes in nude mice. Transplantation. 69 (6), 1084-1090 (2000).
  8. Korbutt, G. S., Mallett, A. G., Ao, Z., Flashner, M., Rajotte, R. V. Improved survival of microencapsulated islets during in vitro culture and enhanced metabolic function following transplantation. Diabetologia. 47 (10), 1810-1818 (2004).
  9. Luca, G., et al. Improved function of rat islets upon co-microencapsulation with Sertoli's cells in alginate/poly-L-ornithine. AAPS PharmSciTech. 2 (3), E15(2001).
  10. Omer, A., et al. Survival and maturation of microencapsulated porcine neonatal pancreatic cell clusters transplanted into immunocompetent diabetic mice. Diabetes. 52 (1), 69-75 (2003).
  11. Schneider, S., et al. Long-term graft function of adult rat and human islets encapsulated in novel alginate-based microcapsules after transplantation in immunocompetent diabetic mice. Diabetes. 54 (3), 687-693 (2005).
  12. Cui, H., et al. Long-term metabolic control of autoimmune diabetes in spontaneously diabetic nonobese diabetic mice by nonvascularized microencapsulated adult porcine islets. Transplantation. 88 (2), 160-169 (2009).
  13. Krishnan, R., Alexander, M., Robles, L., Foster, C. E. 3rd, Lakey, J. R. Islet and stem cell encapsulation for clinical transplantation. Rev Diabet Stud. 11 (1), 84-101 (2014).
  14. Robles, L., Storrs, R., Lamb, M., Alexander, M., Lakey, J. R. Current status of islet encapsulation. Cell Transplant. 23 (11), 1321-1348 (2014).
  15. Desai, T., Shea, L. D. Advances in islet encapsulation technologies. Nat Rev Drug Discov. , (2016).
  16. Anilkumar, A. V., Lacik, I., Wang, T. G. A novel reactor for making uniform capsules. Biotechnol Bioeng. 75 (5), 581-589 (2001).
  17. Wolters, G. H., Fritschy, W. M., Gerrits, D., van Schilfgaarde, R. A versatile alginate droplet generator applicable for microencapsulation of pancreatic islets. J Appl Biomater. 3 (4), 281-286 (1991).
  18. Heinzen, C., Marison, I., Berger, A., von Stockar, U. Use of vibration technology for jet break-up for encapsulation of cells, microbes and liquids in monodisperse microcapsules. Practical Aspects of Encapsulation Technologies. , 19-25 (2002).
  19. Poncelet, D., et al. A Parallel plate electrostatic droplet generator: Parameters affecting microbead size. Applied Microbiology and Biotechnology. 42 (2-3), 251-255 (1994).
  20. Prüße, U., Dalluhn, J., Breford, J., Vorlop, K. D. Production of Spherical Beads by JetCutting. Chemical Engineering & Technology. 23 (12), 1105-1110 (2000).
  21. Hoesli, C. A. Bioprocess development for the cell-based treatment of diabetes (PhD thesis). , University of British Columbia. (2010).
  22. Brandenberger, H., Widmer, F. A new multinozzle encapsulation/immobilisation system to produce uniform beads of alginate. J Biotechnol. 63 (1), 73-80 (1998).
  23. Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation. Br J Surg. 95 (12), 1449-1461 (2008).
  24. Reis, C. P., Neufeld, R. J., Vilela, S., Ribeiro, A. J., Veiga, F. Review and current status of emulsion/dispersion technology using an internal gelation process for the design of alginate particles. J Microencapsul. 23 (3), 245-257 (2006).
  25. Poncelet, D., et al. Production of alginate beads by emulsification/internal gelation. I. Methodology. Appl Microbiol Biotechnol. 38 (1), 39-45 (1992).
  26. Poncelet, D., et al. Production of alginate beads by emulsification/internal gelation. II. Physicochemistry. Applied Microbiology and Biotechnology. 43 (4), 644-650 (1995).
  27. Alexakis, T., et al. Microencapsulation of DNA within alginate microspheres and crosslinked chitosan membranes for in vivo application. Appl Biochem Biotechnol. 50 (1), 93-106 (1995).
  28. Vandenberg, G. W., De La Noue, J. Evaluation of protein release from chitosan-alginate microcapsules produced using external or internal gelation. J Microencapsul. 18 (4), 433-441 (2001).
  29. Silva, C. M., Ribeiro, A. J., Figueiredo, I. V., Goncalves, A. R., Veiga, F. Alginate microspheres prepared by internal gelation: development and effect on insulin stability. Int J Pharm. 311 (1-2), 1-10 (2006).
  30. Larisch, B. C., Poncelet, D., Champagne, C. P., Neufeld, R. J. Microencapsulation of Lactococcus lactis subsp. cremoris. J Microencapsul. 11 (2), 189-195 (1994).
  31. Hoesli, C. A., et al. Reversal of diabetes by betaTC3 cells encapsulated in alginate beads generated by emulsion and internal gelation. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 100 (4), 1017-1028 (2012).
  32. Hoesli, C. A., et al. Pancreatic cell immobilization in alginate beads produced by emulsion and internal gelation. Biotechnol Bioeng. 108 (2), 424-434 (2011).
  33. Reinsel, M. A., Borkowski, J. J., Sears, J. T. Partition Coefficients for Acetic, Propionic, and Butyric Acids in a Crude Oil/Water System. Journal of Chemical & Engineering Data. 39 (3), 513-516 (1994).
  34. Xiu-Dong, L., Wei-Ting, Y., Jun-Zhang, L., Xiao-Jun, M., Quan, Y. Diffusion of acetic acid across oil/water interface in emulsification-internal gelation process for preparation of alginate gel beads. Chemical Research in Chinese Universities. 23 (5), 579-584 (2007).
  35. Fernandez, S. A., et al. Emulsion-based islet encapsulation: predicting and overcoming islet hypoxia. Bioencapsulation Innovations. (220), 14-15 (2014).
  36. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100(2006).
  37. Hinze, J. O. Fundamentals of the hydrodynamic mechanism of splitting in dispersion processes. AIChE Journal. 1 (3), 289-295 (1955).
  38. Kolmogorov, A. N. On the breakage of drops in a turbulent flow (translated from Russian). Doklady Akademii Nauk. 66, 825-828 (1949).
  39. Davies, J. T. Drop Sizes of Emulsions Related to Turbulent Energy-Dissipation Rates. Chemical Engineering Science. 40 (5), 839-842 (1985).
  40. Pacek, A. W., Chamsart, S., Nienow, A. W., Bakker, A. The influence of impeller type on mean drop size and drop size distribution in an agitated vessel. Chemical Engineering Science. 54 (19), 4211-4222 (1999).
  41. Steiner, H., et al. Numerical simulation and experimental study of emulsification in a narrow-gap homogenizer. Chemical Engineering Science. 61 (17), 5841-5855 (2006).
  42. Tcholakova, S., Denkov, N. D., Lips, A. Comparison of solid particles, globular proteins and surfactants as emulsifiers. Phys Chem Chem Phys. 10 (12), 1608-1627 (2008).
  43. Lagisetty, J. S., Das, P. K., Kumar, R., Gandhi, K. S. Breakage of viscous and non-Newtonian drops in stirred dispersions. Chemical Engineering Science. 41 (1), 65-72 (1986).
  44. Draget, K. I., Ostgaard, K., Smidsrod, O. Homogeneous Alginate Gels - a Technical Approach. Carbohydrate Polymers. 14 (2), 159-178 (1990).
  45. Poncelet, D., Dulieu, C., Jacquot, M. Immobilized Cells. Wijffels, R. H. , Springer. Berlin Heidelberg. 15-30 (2001).
  46. Islam, A. W., Zavvadi, A., Kabadi, V. N. Analysis of Partition Coefficients of Ternary Liquid-Liquid Equilibrium Systems and Finding Consistency Using Uniquac Model. Chemical and Process Engineering-Inzynieria Chemiczna I Procesowa. 33 (2), 243-253 (2012).
  47. Quong, D., Neufeld, R. J., Skjak-Braek, G., Poncelet, D. External versus internal source of calcium during the gelation of alginate beads for DNA encapsulation. Biotechnol Bioeng. 57 (4), 438-446 (1998).
  48. De Vos, P., De Haan, B. J., Van Schilfgaarde, R. Upscaling the production of microencapsulated pancreatic islets. Biomaterials. 18 (16), 1085-1090 (1997).
  49. Gross, J. D., Constantinidis, I., Sambanis, A. Modeling of encapsulated cell systems. J Theor Biol. 244 (3), 500-510 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

124

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены