多聚-PAGE:生物样品中的用于拍摄方法和解决蛋白复合体

摘要

一种用于稳定和使用胺反应性蛋白交联剂偶联到一种新颖的二维聚丙烯酰胺凝胶电泳分离未修饰的组织裂解物天然蛋白质复合物的方法（PAGE）系统被呈现。

摘要

有许多用于净化和研究单个蛋白质和肽发达的方法。然而，大多数的细胞功能是由相互作用的蛋白复合物的网络，这往往是难以调查，因为它们的结合是非共价的，并通过纯化技术容易扰动进行。这项工作描述了稳定剂和使用二维聚丙烯酰胺凝胶电泳从未经修饰的组织分离天然蛋白质复合物的方法。组织裂解液加载到非变性蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶，然后施加电电流，直到蛋白质迁移的短距离到凝胶。然后将含有已迁移蛋白质凝胶条带切出，并与该胺反应性交联剂二硫代双（丙酸琥珀酰亚胺酯），其共价稳定的蛋白复合物一起温育。然后将含有交联复合物的凝胶条带浇注成十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶，和叔他配合是完全分开的。该方法依赖于技术和最熟悉的分子生物学家的材料，这意味着它是价格低廉，简单易学。虽然在其充分分离非常大的复合能力是有限的，并没有受到普遍成功，该方法能够捕捉各种充分研究的复合物，并有可能适用于许多感兴趣的系统。

引言

正常细胞功能是依赖于蛋白质-蛋白质相互作用^1,2。其结果是，人类疾病通常是由在不同的蛋白质复合物³的组件和行为的扰动标记。表征这种相互作用的能力因此，至关重要。检测这些相互作用电流的装置需要的靶蛋白，通常随后通过相互作用配偶的下拉的纯化。常规纯化通过差速离心，沉淀和/或色谱法⁴来实现的。这些方法是耗时的，必须改变用于每个靶蛋白，并经常导致低的产率。现代纯化方法涉及肽标签融合到靶蛋白，随后通过免疫沉淀或萃取上装载有结合于捕获分子⁵珠粒柱^，"> 6，虽然这是可扩展到许多蛋白质，这需要目标的序列修饰，潜在地导致在亲和力差异，它们通常的结合配偶体的构建体。一些蛋白质-蛋白质相互作用的微妙特性意味着这种方法可能不适用许多方案。另外，用于映射蛋白质 - 蛋白质相互作用的下拉测定法可以不捕获准确蜂窝图片，由于受限制的自由度和诱饵蛋白的非天然的水平。

理想情况下，蛋白复合物能够在他们的原生状态进行检测，而不需要净化或下拉。蓝色非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）被开发作为变性少替代十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），并允许某些蛋白质和复合物从生物样品⁷的分离。然而，在BN-PAGE蛋白质分离的基础上LARGE数的变量，包括大小，电荷，三维结构，和关联与其他分子。这些因素的相互作用通常导致蛋白质的共分离，聚集体形成，差的蛋白质条带的分辨率。二维原生聚丙烯酰胺凝胶电泳解决了一些，但不是全部，这些问题^8。

为了避开与天然分离相关的并发症，一些作者使用胺反应性的交联试剂，如二硫代双（琥珀酰亚胺丙酸酯）（DSP），以捕获蛋白复合物在组织裂解物^4。然后将这些处理过的溶胞产物可变性，并通过SDS-PAGE分离，同时保持蛋白质复合物的天然大小和化妆。然而，由于交联试剂反应基于一个分子到另一个的接近度，以及在组织裂解液的蛋白质具有许多自由度，并且可以随机相互作用，非特异性背景交叉-linking可以是高的，尤其是浓缩的样品英寸这可能会导致难以解释结果。

在这里，我们证明了使用混合BN-PAGE / SDS-PAGE的方法，被称为多聚聚丙烯酰胺凝胶电泳（多聚-PAGE），以分离和复杂混合物中检测蛋白组件。最初，细胞裂解物通过BN-PAGE悬浮于聚丙烯酰胺凝胶。含溶胞产物 - 凝胶，然后用交联试剂DSP反应。伪固定，并略微在凝胶上分离，蛋白可能非特异性反应少得多，这意味着背景交联剂反应性降低。交联后，将凝胶条带切下并通过SDS-PAGE分离。将所得的凝胶然后可以通过典型地与聚丙烯酰胺凝胶电泳相关的任何手段进行分析。这种方法允许在未修饰的组织裂解物天然蛋白质复合物的分离和检测，而无需额外的纯化或上拉陶氏ñ。

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研究方案

1.组织制备

1. 制备4×BN-PAGE样品缓冲液（200mM双（2-羟乙基）氨基 - 三（羟甲基）甲烷（的Bis-Tris），200mM的氯化钠，40％w / v的甘油，0.004％丽春红S，pH为7.2的10毫升）。
   注意:此储备溶液可以预先制成，并储存在4℃。
2. 稀释4倍的样品缓冲液的250μL750μL卫生署₂含有1x商业蛋白酶抑制剂混合物O操作。涡和冰中冷却。
3. 均质化20毫克目标组织的在用干净的Dounce匀浆的30个行程1个毫升1X冰冷BN-PAGE样品缓冲液中。
   注:对于这个演示实验中，目标组织是整个大鼠脑组织。均化后，样品可以用温和的去污剂如2％毛地黄皂苷处理以溶解和允许膜蛋白的电泳。
4. 转移匀浆到1.5mL微量离心管中，并离心以14,000×g离心30分钟以沉淀不溶细胞内容物。 AFTEř离心，倒出上清液到在冰上干净的管中。
5. 遵循制造商的说明书使用二辛可宁酸（BCA）或类似的蛋白定量测定法来测量上清液蛋白质浓度。
6. 如果匀浆样品（一个或多个）含有的洗涤剂，在水溶液中足以使匀浆溶液至0.25％考马斯添加5％考马斯蓝G-250的量。

2. BN-PAGE

1. 稀释25毫升20×蓝色天然（BN）电泳缓冲液的库存（1.0M的Bis-Tris，1.0M甘氨酸，pH6.8）中为475毫升含卫生署0.002％考马斯蓝，使500毫升1×电泳缓冲液的₂ O。
   1. 如果样品含有洗涤剂，代替使250毫升含0.02％考马斯1X运行缓冲液和含有无另一个250毫升。
2. 冷硬缓冲器（一个或多个），以4℃。
3. 清洗和组装的聚丙烯酰胺凝胶，根据制造商的说明书浇注盒。
4. 根据标准配方⁷倾BN的聚丙烯酰胺凝胶（3％T堆叠层，6％T分解层），并放置好梳子。
5. 凝胶具有聚合后，冲洗与卫生署₂ O的盒子和根据制造商说明书组装电泳装置。
6. 删除以及梳子，并与1X BN-PAGE电泳缓冲液填充井。避免用缓冲液填充整个内室，直到样品被加载。
   1. 如果样品含有洗涤剂，填孔用含有0.02％考马斯蓝的缓冲区。
      注意:在4℃下执行步骤2.7-2.9。
7. 使用凝胶加载提示，吸取含有20μg蛋白质的成所需井匀浆的体积。移液器1X BN-PAGE样品缓冲液的等体积到任何未使用的孔中。
   注意:使用从BCA测定法测定蛋白质浓度，以计算匀浆适当体积添加到井。
8. 样品装载之后，填充用1x BN-PAGE电泳缓冲液内室。确保凝胶在缓冲液完全淹没。接着，填充用1x运行缓冲液外室由制造商所指示的电平。
   1. 如果样品含有洗涤剂，填用含有0.02％考马斯蓝的1X缓冲液，并用无染料1X运行缓冲液外室的内室。
9. 将电极连接到电源，并在150V electrophorese将凝胶中的蛋白质直到染料带前进〜2厘米的分辨层。停止并断开电源。

3.交联

注意:在4℃下执行步骤3.1-3.6。

1. 拆卸电泳装置中，并分离凝胶盒的玻璃板。卸下并丢弃堆叠层。
2. 小心切开刚好低于染料前端的底部边缘的凝胶。采取护理使这种馏分作为平直越好，然后丢弃未使用的片凝胶。这将留下〜2厘米宽，聚丙烯酰胺凝胶的水平条，其中将包含匀浆样品中的所有蛋白质。
3. 修剪掉沿凝胶条带的边缘的任何未使用的部分。
4. 小心地将条插入在一个小容器10毫升磷酸盐缓冲盐水（PBS），并轻轻地由章动30分钟以平衡混合。
5. 平衡之后，丢弃并用另一个10毫升替换PBS。吸移管500的μL的25mM DSP溶解于二甲基亚砜入PBS，并继续30分钟如上（步骤3.4）混合。
6. 倒掉DSP溶液。添加0.375的1M Tris（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐（的Tris-HCl），pH值8.8，含有2％十二烷基硫酸钠（SDS）10毫升以猝灭未反应的DSP。继续垂头15分钟。

4. SDS-PAGE

1. 虽然凝胶条带淬火，制备SDS-PA根据标准方法⁹ GE凝胶溶液。不添加聚合试剂。
2. 骤冷后，返回ΒΝ凝胶条带至室温，并在带材浇注到一个新的凝胶盒。
   1. 要做到这一点，小心拿起凝胶，并将其放置到一个干净的凝胶盒隔板。
   2. 东方带所以染料前端的底部最接近新磁带盒的顶部（ 即 ，在BN-PAGE行进最远的一侧应该被最接近新磁带盒的顶部;将凝胶条应从其先前被翻转方向）。参见图3。
   3. 放置条带，使得其顶部边缘在于即使其中所述盖板的顶部边缘会（ 即 ，这将是在新的凝胶的顶部）。确保染料前端平行于所述玻璃板的水平边缘。
   4. 推压隔板壁中的一个切下的带材的一侧上，留下上吨室他另一侧用于凝胶被倾并且要加载的蛋白质标准或梯子。
   5. 如果凝胶条的底部边缘中包含任何锯齿或不平整区域，小心切割他们离开。如果存在的话，它们将凝胶中的气泡陷阱浇注。
   6. 一旦凝胶条被正确地定位，笼罩间隔板盖板。轻轻推压，推出任何夹带的气泡。
   7. 继续根据制造商说明书来组装凝胶浇注装置。
3. 添加聚合试剂分离胶缓冲液，并且使用血清移液管倒在制得的凝胶盒，。填充凝胶盒至〜2厘米切除BN-PAGE凝胶带的下方，以留有余地，堆叠层。
4. 添加100μL丁醇在倾倒凝胶的顶部，并允许分辨层的聚合30分钟。倒掉丁醇。
5. 添加聚合试剂于堆叠凝胶溶液。使用serolog移液管的iCal，倒入堆叠层以填充在凝胶盒的所有剩余空白空间。
   1. 倾斜凝胶盒作为层叠层倾倒，使其填充胶条下方的空间，并且气泡不会夹。
   2. 作为层叠凝胶缓冲液填充该凝胶条下面的空的空间，逐渐将凝胶盒返回到电平的基础上。
   3. 不断填补空白与浓缩胶缓冲切除的胶条旁边，直到它几乎溢出。
6. 允许堆叠层聚合30分钟。
   注意:请10X SDS-PAGE电泳缓冲液（250mM的三（羟甲基）氨基甲烷（TRIS），1.9甘氨酸，1％SDS），同时将凝胶聚合。这也可以预先制成，在室温下储存。
7. 稀释50毫升10X SDS-PAGE电泳缓冲液库存入450毫升卫生署₂ O，使1×操作缓冲液。
8. 堆叠层具有聚合后，从浇注取出凝胶盒设备，冲洗与卫生署₂ O，并根据制造商说明书组装电泳装置。
9. 用1x SDS-PAGE电泳缓冲液完全充满内腔，然后填充该外室由制造商所指示的电平。
10. 装入空间的分子量梯或适当蛋白质标准的切下的凝胶条带旁边。
11. 连接电极到电源，并且当考马斯染料跑出凝胶electrophorese在120 V.样品，停止和断开电源。
12. 分析使用电印迹和蛋白质检测的标准方法通过抗体结合¹⁰的凝胶。

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结果

在这个演示实验，多聚-PAGE是在整个大鼠脑裂解液进行。将所得的分离的蛋白质印迹到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，然后用针对已知能形成复合物的蛋白质的抗体进行探测。 图1示出了通过两种方式的协议的验证。首先，我们表明，交联的蛋白是可裂解通过加入还原剂的，这意味着所观察到的较高分子量的物质通过交联试剂形成，并且不是由于协议（ 图1A?...

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讨论

蛋白质 - 蛋白质相互作用是每个任务万物开展重要。正因为如此，他们是严格审查和研究的课题。多聚-PAGE是用于捕获，分离，和分析广泛的蛋白复合物的新方法。之前我们已经证实其适用于研究疾病相关蛋白α突触核蛋白¹¹ oligimerization。然而，它是可扩展到许多蛋白复合物，如在图2证实。当与学习蛋白复合物的其他方法，多聚-PAGE是因为它的简单和简洁的是有利的?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
ε-Aminocaproic acid	Sigma	A2504
Acrylamide	Acros Organics	164855000	Toxic.
Acrylamide/bisacrilamide 37.5:1 (40%T stock solution)	BioRad	161-0148	Toxic.
Ammonium persulfate	Sigma	A3678
Anti rabbit IgG-HRP from goat	Santa Cruz Biotechnology	sc-2004
Bicinchoninic acid assay kit	Thermofisher	23225
Bis-tris	Sigma	B9754
Bovine serum albumin	Sigma	A9647
Butanol	Fisher Scientific	A399-1
Chemiluminescence substrate kit	ThermoFisher	24078
Coomassie blue G-250	Sigma-Aldrich	B0770
Digitonin	Sigma	D141	Toxic.
Dimethyl sulfoxide	Fisher Scientific	D128-1
Dithiobis(succinimidylpropionate)	Thermo Scientific	22585
Dry nonfat milk	LabScientific	M0841
Glycerol	Sigma	G9012
Glycine	Fisher Scientific	BP381-5
Halt Protease Inhibitor Cocktail	Thermofisher	78430
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A144SI-212	For titration. Caustic.
Methanol	Fisher Scientific	A412-4	For PVDF membrane activation. Toxic.
Monoclonal anti α-synuclein IgG from rabbit	Santa Cruz Biotechnology	sc-7011-R
N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine	Sigma	T9281
N,N'-methylenebisacrylamide	Acros Organics	16479	Toxic.
NP40	Boston Bioproducts	P-872
Polysorbate 20 (tween-20)	Fisher Scientific	BP337-500
Polyvinylidene fluoride transfer membranes	Thermo Scientific	88518
Ponceau S	Sigma	P3504
Potassium chloride	Fisher Scientific	P217-3
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P9791
Protease inhibitor cocktail	Thermo Scientific	88265
SDS solution (10% w/v)	BioRad	161-0416
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-212
Sodium dodecyl sulfate	Sigma	L37771
Sodium phosphate monobasic	Fisher Scientific	BP329-1
Tricine	Sigma	T0377
Tris base	Fisher Scientific	BP152-500
Tris-HCl (0.5 M buffer, pH 6.8)	BioRad	161-0799
Tris-HCl (1.5 M buffer, pH 8.8)	BioRad	161-0798
Name	Company	Catalog Number	Comments
Instruments
GE Imagequant LAS 4000	GE Healthcare	28-9558-10
ImageJ software	NIH
Synergy H1 microplate reader	BioTek
Gel Former + Stand	Biorad
Microfuge 22R centrifuge	Beckman Coulter
2 mL dounce homogenizer
Vortex mixer	Fisher Scientific
Ultrasonic tissue homogenizer	Fisher Scientific	FB120220