Multimer-PAGE: Ein Verfahren zum Erfassen und Auflösen von Proteinkomplexen in biologischen Proben

Zusammenfassung

Verfahren zur Stabilisierung und Trenn nativen Proteinkomplexe aus unmodifizierten Gewebelysat gekoppelt, um ein Amin-reaktives Protein Vernetzers unter Verwendung von auf eine neuartige zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) -System dargestellt.

Zusammenfassung

Es gibt viele gut entwickelte Methoden zur Reinigung und einzelne Proteine ​​und Peptide zu studieren. Allerdings sind die meisten zellulären Funktionen von Netzwerken interagierender Proteinkomplexen durchgeführt, die oft schwierig zu untersuchen, da ihre Bindung nicht-kovalent und leicht durch Reinigungstechniken gestört. Diese Arbeit beschreibt ein Verfahren zur Stabilisierung und Trenn native Protein-Komplexe aus nicht-veränderten Geweben zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter Verwendung von. Tissue-Lysat wird auf eine nicht-denaturierenden blau-native Polyacrylamidgel geladen, dann wird ein elektrischer Strom angelegt wird, bis das Protein, das eine kurze Strecke in das Gel wandert. Die Gelstreifen die migrierten Protein enthält, wird dann mit den aminreaktiven Vernetzungsreagenz Dithiobis (succinimidylpropionat), das kovalent Protein ausgeschnitten und inkubiert Komplexe stabilisiert. Die Gelstreifen vernetzten Komplexe enthalten, werden dann ein Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel eingegossen, und tEr komplexe sind vollständig getrennt. Die Methode beruht auf Techniken und Materialien, die den meisten Molekularbiologen vertraut sind, was bedeutet, dass es kostengünstig und leicht zu erlernen ist. Während es in seiner Fähigkeit, äußerst große Komplexe adäquat zu trennen, begrenzt ist und nicht allgemein erfolgreich war, war die Methode in der Lage, eine Vielzahl von gut untersuchten Komplexen zu erfassen und ist wahrscheinlich auf viele interessierende Systeme anwendbar.

Einleitung

Normale zelluläre Funktion ist abhängig von Protein-Protein - Wechselwirkungen ^{1, 2.} Als Ergebnis werden menschliche Krankheiten , die oft durch Störungen in der Montage und Verhalten verschiedenen Proteinkomplexe ³ markiert. Die Fähigkeit, solche Interaktionen zu charakterisieren, ist daher von entscheidender Bedeutung. Aktuelle Mittel, um diese Wechselwirkungen zur Detektion erfordern Reinigung von Zielproteinen, die oft durch Pull-Down ihrer Interaktionspartner gefolgt. Herkömmliche Reinigung wird durch differentielle Zentrifugation, Präzipitation durchgeführt, und / oder Chromatographie ^4. Diese Verfahren sind zeitaufwendig, muss für jedes Zielprotein verändert werden, und führen oft zu geringen Ausbeuten. Moderne Reinigungsverfahren umfassen die Fusion von Peptid - Tags an Zielproteine, durch Immunpräzipitation oder Extraktion auf Säulen , gefolgt mit Perlen zu einem Einfang - Moleküle gebunden ⁵ geladen wird ^,„> 6. Während dieses erweiterbaren viele Proteine ist, erfordert es Sequenzmodifikation des Ziels, möglicherweise in Konstrukten führt , die für ihre üblichen Bindungspartner in der Affinität unterscheiden. Die empfindliche Natur einiger Protein-Protein - Wechselwirkungen , bedeutet dieses Verfahren nicht anwendbar sein kann viele Szenarien. Außerdem ist das Pull-down-Assays verwendet, um Protein-Protein-Wechselwirkungen abbilden kann keine genaue zelluläre Bild erfassen, aufgrund eingeschränkter Freiheitsgrade und nicht-nativen Mengen des Köders Proteins.

Idealerweise Proteinkomplexe könnten zur Reinigung oder Pull-Down ohne die Notwendigkeit, in ihren Heimatstaat nachgewiesen werden. Blau nativen Polyacrylamid - Gelelektrophorese (BN-PAGE) wurde als weniger denaturierende Alternative zu Natriumdodecylsulfat - Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) entwickelt und erlaubt die Trennung von einigen Proteinen und Komplexen aus biologischen Proben ^7. Eine getrennte Proteine ​​in BN-PAGE auf Basis eines LARge Anzahl von Variablen, einschließlich der Größe, Ladung, dreidimensionale Struktur, und die Assoziation mit anderen Molekülen. Die Wechselwirkungen dieser Faktoren führen häufig in Zusammenarbeit Trennung von Proteinen, die Aggregatbildung und schlechter Proteinbande Auflösung. Zweidimensionale nativer Polyacrylamid - Gelelektrophorese löst einige, aber nicht alle dieser Probleme ^8.

Um die Komplikationen zu umgehen mit nativer Trennung verbunden sind , verwenden einige Autoren aminreaktive Vernetzungsreagenzien, wie Dithiobis (succinimidylpropionat) (DSP), Proteinkomplexe in Gewebelysaten ⁴ zu erfassen. Diese behandelten Lysate können dann durch SDS-PAGE denaturiert und abgetrennt werden, während die native Größe und Zusammensetzung von Proteinkomplexen zu erhalten. Da jedoch die Vernetzungsreagenzien auf die Nähe von einem Molekül zum anderen auf Basis reagieren und Proteine ​​in Gewebe-Lysaten haben viele Freiheitsgrade und kann stochastisch interagieren, nicht-spezifischen Hintergrund Quer-Verknüpfung kann in konzentrierten Proben hoch, vor allem sein. Dies kann schwierig zu interpretierenden Ergebnissen führen zu.

Hier stellen wir die Verwendung eines Hybrid-BN-PAGE / SDS-PAGE-Verfahren zeigen, bezeichnet als Multimer-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (Multimer-PAGE), zu trennen, und das Protein Baugruppen in komplexen Mischungen zu erfassen. Anfänglich wird Zelllysat in Polyacrylamidgel über BN-PAGE suspendiert. Das Lysat enthaltende Gel wird dann mit dem Vernetzungsreagenz DSP. Pseudo-immobilisierte und leicht auf dem Gel aufgetrennt, Proteine ​​sind viel weniger wahrscheinlich unspezifisch zu reagieren, was bedeutet, Hintergrund Vernetzers Reaktivität verringert wird. Nach der Vernetzung werden die Gel-Banden ausgeschnitten und mittels SDS-PAGE getrennt. Das resultierende Gel kann dann durch ein beliebiges Mittel typischerweise mit Polyacrylamidgelelektrophorese assoziiert analysiert werden. Dieses Verfahren ermöglicht die Trennung und den Nachweis von nativen Proteinkomplexen in unmodifizierter Gewebelysat, ohne die Notwendigkeit für eine zusätzliche Reinigung oder Pull-Down.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokoll

1. Gewebepräparation

1. Herstellung von 10 ml der 4-fach BN-PAGE-Probenpuffer (200 mM Bis (2-hydroxyethyl) amino-tris (hydroxymethyl) methan (Bis-Tris), 200 mM NaCl, 40% w / v Glycerin, 0,004% Ponceau S, pH 7,2 ).
   HINWEIS: Diese Stammlösung im Voraus und bei 4 ° C durchgeführt werden kann.
2. Verdünnte 250 ul 4x Probenpuffer in 750 & mgr; l dH ₂ O , enthaltend 1x kommerziellen Protease - Inhibitor - Cocktail. Vortex und Chill auf Eis.
3. Homogenisiert 20 mg des Zielgewebes in den 1 ml 1x eiskalten BN-PAGE-Probenpuffern mit 30 Schlägen eines Dounce-Homogenisators sauber.
   HINWEIS: Für dieses Demonstrationsexperiment, das Zielgewebe ganze Rattenhirngewebe. Nach der Homogenisierung Proben werden mit einem milden Reinigungsmittel, wie beispielsweise 2% Digitonin zu solubilisieren und erlauben Elektrophorese von Membranproteinen behandelt.
4. Überträgt das Homogenisat in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugiert bei 14.000 xg für 30 min unlöslichen Zellinhalt zu pelletieren. after Zentrifugieren dekantiert den Überstand in ein sauberes Röhrchen auf Eis.
5. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers überstehende Flüssigkeit Proteinkonzentration unter Verwendung von Bicinchoninsäure (BCA) oder ähnlichen Proteinquantifizierung Assay zu messen.
6. Wenn das Homogenat Probe (n) Reinigungsmittel enthält, eine Menge von 5% Coomassie Blue G-250 in wässriger Lösung hinzu ausreichen, um die Lösung Homogenat Coomassie bis 0,25% zu bringen.

2. BN-PAGE

1. Verdünne 25 ml 20x blau nativen (BN) Elektrophoresepuffer Lager (1,0 M Bis-Tris, 1,0 M Tricin, pH 6,8) in 475 ml dH ₂ O 0,002% Coomassie - Blau , das 500 ml 1x Laufpuffer zu machen.
   1. Wenn Proben Reinigungsmittel enthalten, stellen stattdessen 250 ml 1x Laufpuffer, enthaltend 0,02% Coomassie und weitere 250 ml enthielt keine.
2. Chill-Puffer (n) auf 4 ° C.
3. Reinigen und montieren ein Polyacrylamidgel Ausgießen Kassette nach Herstelleranweisungen.
4. BN Polyacrylamidgel (3% T Stapelschicht, 6% T Auflösungsschicht) Gießen nach einem Standardrezept ⁷ und legen den gut Kamm.
5. Nachdem die Gele polymerisiert haben, spülen Sie die Elektrophoresevorrichtung gemäß Herstelleranweisungen , um die Kassette mit dH ₂ O und zusammenzubauen.
6. Entfernen Sie die gut Kamm und füllen die Vertiefungen mit 1x BN-PAGE - Laufpuffer. Vermeiden die gesamte Innenkammer mit Puffer füllt , bis Proben geladen werden.
   1. Wenn Proben Waschmittel enthalten, füllen die Vertiefungen mit dem Puffer 0,02% Coomassie-Blau enthält.
      HINWEIS: Führen Sie die Schritte 2,7-2,9 bei 4 ° C.
7. Verwendung von Gel-Ladespitzen, eine Pipette mit einem Volumen von Homogenisats, das 20 ug Protein in die gewünschten Vertiefungen. Pipette ein äquivalentes Volumen von 1x BN-PAGE-Probenpuffer, in einem nicht genutzten Vertiefungen.
   HINWEIS: Die Proteinkonzentration aus dem BCA-Test bestimmt das geeignete Volumen des Homogenats berechnen hinzuzufügenDie Brunnen.
8. Nachdem die Proben geladen sind, füllen Sie die innere Kammer mit 1x BN-PAGE-Laufpuffer. Seien Sie sicher, dass das Gel vollständig in Puffer untergetaucht ist. Als nächstes füllen Sie die Außenkammer mit 1x Laufpuffer auf das vom Hersteller angegebene Niveau.
   1. Wenn Proben Waschmittel enthalten, füllen Sie die innere Kammer mit dem 1x Puffer, der 0,02% Coomassie Blue enthält, und die äußere Kammer mit farbstofffreiem 1x Laufpuffer.
9. Verbinden Sie die Elektroden mit der Stromversorgung und elektrophorieren Sie die Proteine ​​im Gel bei 150 V, bis das Farbstoffband ~ 2 cm in die Auflösungsschicht fortschreitet. Stoppen und trennen Sie die Stromversorgung.

3. Vernetzung

HINWEIS: Die Schritte 3.1-3.6 bei 4 ° C durchführen.

1. Demontieren Sie den Elektrophoreseapparat und trennen Sie die Glasscheiben der Gelkassette. Entfernen und entsorgen Sie die Stapelschicht.
2. Sorgfältig das Gel kurz unterhalb der Unterkante der Farbstofffront schneiden. NehmenPflege dieses Schnitt so glatt und gerade wie möglich zu machen, und dann die nicht verwendete Gelstück verwerfen. Dies wird einen ~ 2 cm breite, horizontale Streifen aus Polyacrylamidgel, läßt die alle das Protein in der Probe Homogenat enthalten.
3. Wegschneiden alle nicht verwendeten Teile entlang der Kanten des Gelstreifens.
4. Legen Sie das Band in 10 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) in einem kleinen Behälter, und sanft durch Nutation mischte für 30 Minuten äquilibrieren.
5. Nach der Äquilibrierung verwerfen und das PBS mit weiteren 10 mL ersetzen. Pipette 500 ul 25 mM DSP in Dimethylsulfoxid in das PBS gelöst und weiter wie oben (Schritt 3.4) für 30 min gemischt wurde.
6. Gießen Sie die DSP-Lösung ab. 10 ml 0,375 M Tris (hydroxymethyl) aminomethanhydrochlorid (Tris-HCl), pH 8,8, enthaltend 2% Natriumdodecylsulfat (SDS), um das nicht umgesetzte DSP quenchen. Weiter Nutation für 15 min.

4. SDS-PAGE

1. Während Gelstreifen wird Abschrecken herzustellen SDS-PAGE Gellösungen nach Standardmethoden ^9. Nicht Polymerisationsreagentien hinzuzufügen.
2. Nach dem Abschrecken auf Raumtemperatur zurückkehren die ΒΝ Gelstreifen, und der Streifen in eine neue Gelkassette gegossen.
   1. Um dies zu tun, nehmen Sie vorsichtig das Gel und legen Sie sie auf eine saubere Gelkassette Distanzplatte.
   2. Orient der Streifen , so dass die Unterseite der Farbstofffront ist am nächsten an der Spitze der neuen Kassette (dh die Seite, die am weitesten in BN-PAGE gereist sollte auf der Oberseite der neuen Kassette am nächsten ist, der Gelstreifen aus seiner vorherigen umgedreht werden soll Orientierung). Siehe Abbildung 3.
   3. Platzieren Sie den Streifen so , dass seine Oberkante liegt auch bei denen die Oberkante der Abdeckplatte wird ( das heißt, es wird an der Oberseite des neuen Gel sein). Sicherstellen, dass die Farbstofffront parallel zu den horizontalen Kanten der Glasplatte.
   4. Schieben einer Seite des ausgeschnittenen Streifens gegen einen der Abstandshalterwände, so dass Raum für ter andere Seite für Gel gegossen werden und ein Protein-Standard oder Leiter geladen werden.
   5. Wenn die Unterkante des Gelstreifens irgendwelche gezackten oder unebene Bereiche enthält, schneiden sie sorgfältig entfernt. Falls vorhanden, werden diese Blasen während trap Gelgießlösung.
   6. Sobald die Gelstreifen korrekt positioniert ist, legte die Abdeckplatte über die Distanzplatte. Drücken Sie vorsichtig heraus drücken alle eingeschlossenen Luftblasen.
   7. Weiterhin die gel-Gießvorrichtung nach Herstelleranleitung montieren.
3. Hinzufügen Polymerisation Reagenzien zu dem Trenngel-Puffer und gießt es in die vorbereitete Gelkassette eine serologische Pipette. Füllen Sie das Gelkassette auf ~ 2 cm unterhalb der ausgeschnittenen BN-PAGE Gelstreifen, Raum für die Stapelung Schicht zu verlassen.
4. Füge 100 & mgr; l Butanol über die oberen Rand des Gels gegossen, und ermöglicht es 30 Minuten zur Polymerisation des Auflösungsschicht. Gießen Sie das Butanol aus.
5. In Polymerisationsreagentien zur Stapel Gel - Lösung. Mit einem serologische Pipette, gieße die Stapelschicht alle verbleibenden Leerraum in der Gelkassette zu füllen.
   1. Neigen die Gelkassette als die Stapelschicht gegossen wird, so dass er den Raum unterhalb des Gelstreifens füllt, und Luftblasen werden nicht aufgefangen.
   2. Da die Stapelung Gelpuffer den leeren Raum unter dem Gelstreifen füllt, kehrt allmählich die Gelkassette auf Augenhöhe.
   3. neben dem exzidierten Gelstreifen mit dem Stapel Gelpuffer, bis es fast überläuft weiterhin den leeren Raum zu füllen.
6. Ermöglicht die Stapelschicht für 30 Minuten zu polymerisieren.
   HINWEIS: Stellen 10x SDS-PAGE-Laufpuffer (250 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethan (Tris), 1,9 M Glycin, 1% SDS), während das Gel polymerisiert. Dies kann auch im Vorfeld und bei Raumtemperatur gelagert gemacht werden.
7. Verdünne 50 mL 10X - SDS-PAGE - Laufpuffer Lager in 450 ml dH ₂ O 1x Arbeitspuffer zu machen.
8. Nachdem die Stapelschicht polymerisiert ist, entfernen Sie die Gelkassette von strömendemVorrichtung, Spülen mit dH ₂ O, und montiert die Elektrophoresevorrichtung nach Herstelleranweisungen.
9. Füllen der inneren Kammer vollständig mit 1x SDS-PAGE-Laufpuffer, dann die Außenkammer durch den Hersteller angegeben auf das Niveau füllen.
10. Laden den Raum neben dem exzidierten Gelstreifen mit einem Molekulargewicht Leiter oder geeigneten Proteinstandard.
11. Befestigen der Elektroden an die Stromversorgung, und Elektrophorese der Proben bei 120 V. Wenn der Farbstoff Coomassie das Gel abläuft, stoppen und die Stromversorgung trennen.
12. Analysieren des Gels unter Verwendung von Standardverfahren des Elektroblotting und Proteindetektion durch Antikörperbindung ^10.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ergebnisse

In dieser Demonstration Experiment wurde Multimer-PAGE auf ganzem Rattenhirn-Lysat durchgeführt. Die resultierenden getrennten Proteine ​​wurden auf Polyvinylidendifluorid (PVDF) Membranen geblottet und dann mit Antikörpern gegen Proteine ​​untersucht, die Komplexe sind dafür bekannt, zu bilden. Abbildung 1 zeigt eine Validierung des Protokolls durch zwei Mittel. Erstens, zeigen wir , dass die vernetzten Proteine durch Zugabe eines Reduktionsmittels abspaltbar...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Diskussion

Protein-Protein-Wechselwirkungen sind wichtig für jede Aufgabe Lebewesen auszuführen. Aus diesem Grunde sind sie Gegenstand intensiver Prüfung und Forschung. Multimer-PAGE ist ein neues Verfahren für die Erfassung, trennt, und eine Vielzahl von Proteinkomplexen zu analysieren. Wir haben bereits gezeigt , seine Anwendbarkeit oligimerization des krankheitsassoziierten Protein α-Synuclein ¹¹ bis zu studieren. Jedoch ist es dehnbar zu vielen Proteinkomplexen, wie in Abbildung 2 ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
ε-Aminocaproic acid	Sigma	A2504
Acrylamide	Acros Organics	164855000	Toxic.
Acrylamide/bisacrilamide 37.5:1 (40%T stock solution)	BioRad	161-0148	Toxic.
Ammonium persulfate	Sigma	A3678
Anti rabbit IgG-HRP from goat	Santa Cruz Biotechnology	sc-2004
Bicinchoninic acid assay kit	Thermofisher	23225
Bis-tris	Sigma	B9754
Bovine serum albumin	Sigma	A9647
Butanol	Fisher Scientific	A399-1
Chemiluminescence substrate kit	ThermoFisher	24078
Coomassie blue G-250	Sigma-Aldrich	B0770
Digitonin	Sigma	D141	Toxic.
Dimethyl sulfoxide	Fisher Scientific	D128-1
Dithiobis(succinimidylpropionate)	Thermo Scientific	22585
Dry nonfat milk	LabScientific	M0841
Glycerol	Sigma	G9012
Glycine	Fisher Scientific	BP381-5
Halt Protease Inhibitor Cocktail	Thermofisher	78430
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A144SI-212	For titration. Caustic.
Methanol	Fisher Scientific	A412-4	For PVDF membrane activation. Toxic.
Monoclonal anti α-synuclein IgG from rabbit	Santa Cruz Biotechnology	sc-7011-R
N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine	Sigma	T9281
N,N'-methylenebisacrylamide	Acros Organics	16479	Toxic.
NP40	Boston Bioproducts	P-872
Polysorbate 20 (tween-20)	Fisher Scientific	BP337-500
Polyvinylidene fluoride transfer membranes	Thermo Scientific	88518
Ponceau S	Sigma	P3504
Potassium chloride	Fisher Scientific	P217-3
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P9791
Protease inhibitor cocktail	Thermo Scientific	88265
SDS solution (10% w/v)	BioRad	161-0416
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-212
Sodium dodecyl sulfate	Sigma	L37771
Sodium phosphate monobasic	Fisher Scientific	BP329-1
Tricine	Sigma	T0377
Tris base	Fisher Scientific	BP152-500
Tris-HCl (0.5 M buffer, pH 6.8)	BioRad	161-0799
Tris-HCl (1.5 M buffer, pH 8.8)	BioRad	161-0798
Name	Company	Catalog Number	Comments
Instruments
GE Imagequant LAS 4000	GE Healthcare	28-9558-10
ImageJ software	NIH
Synergy H1 microplate reader	BioTek
Gel Former + Stand	Biorad
Microfuge 22R centrifuge	Beckman Coulter
2 mL dounce homogenizer
Vortex mixer	Fisher Scientific
Ultrasonic tissue homogenizer	Fisher Scientific	FB120220