Multimère-PAGE: un procédé de capture et de résolution de complexes de protéines dans des échantillons biologiques

Résumé

Procédé pour la stabilisation et la séparation des complexes de protéines natives à partir de lysat de tissu non modifié en utilisant une protéine réactive amine agent de réticulation couplé à une nouvelle électrophorèse sur gel de polyacrylamide en deux dimensions (PAGE) système est présentée.

Résumé

Il existe de nombreuses méthodes bien développées pour purifier et étudier des protéines et des peptides uniques. Cependant, la plupart des fonctions cellulaires sont réalisées par des réseaux de complexes de protéines qui interagissent, qui sont souvent difficiles à étudier car leur liaison n'est pas covalente et facilement perturbée par des techniques de purification. Ce travail décrit une méthode de stabilisation et de séparation des complexes de protéines indigènes à partir de tissus non modifiés en utilisant une électrophorèse en gel de polyacrylamide bidimensionnelle. Le lysat de tissu est chargé sur un gel de polyacrylamide natif non dénaturant, puis on applique un courant électrique jusqu'à ce que la protéine migre à une courte distance dans le gel. La bande de gel contenant la protéine migrée est ensuite excisée et incubée avec le réactif réticulant réactif à l'aminé dithiobis (propionate de succinimidyle), qui stabilise de manière covalente les complexes de protéines. La bande de gel contenant des complexes réticulés est ensuite jetée dans un gel de polyacrylamide de dodécyl sulfate de sodium et til complexes sont séparés complètement. La méthode repose sur des techniques et des matériaux familiers à la plupart des biologistes moléculaires, ce qui signifie qu'il est peu coûteux et facile à apprendre. Bien qu'il soit limité dans sa capacité à séparer suffisamment complexes de très grande taille, et n'a pas été universellement avec succès, la méthode a été en mesure de capturer une grande variété de complexes bien étudiés, et probablement applicable à de nombreux systèmes d'intérêt.

Introduction

La fonction cellulaire normale est dépendante des interactions protéine-protéine ^{1, 2.} En conséquence, les maladies humaines sont souvent marqués par des perturbations dans l'assemblage et le comportement de différents complexes protéiques ^3. La capacité de caractériser ces interactions est donc essentiel. Les moyens actuels de détection de ces interactions nécessitent la purification des protéines cibles, souvent suivies de pull-down de leurs partenaires d'interaction. Purification classique est réalisée par centrifugation différentielle, la précipitation, et / ou Chromatographie ^4. Ces méthodes sont de temps, doivent être modifiés pour chaque protéine cible, et donnent souvent lieu à des rendements faibles. Méthodes de purification modernes impliquent la fusion des balises de peptides à des protéines cibles, suivie par une immunoprécipitation ou par extraction sur des colonnes chargées avec des billes liées à une molécule de capture ^5,« > 6. Bien que ce soit extensible à de nombreuses protéines, il nécessite une modification de la séquence de la cible, ce qui pourrait entraîner des constructions qui diffèrent par affinité pour leurs partenaires de liaison habituels. La nature délicate de certaines interactions protéine-protéine signifie que cette méthode ne peut pas être applicable de nombreux scénarios. de plus, les tests déroulants utilisés pour cartographier les interactions protéine-protéine ne peut pas capturer une image précise cellulaire, en raison de degrés de liberté restreints et les niveaux non natifs de la protéine appât.

Idéalement, les complexes de protéines pourraient être détectés dans leur état d'origine, sans nécessiter de purification ou de tirer vers le bas. Natif bleu électrophorèse sur gel de polyacrylamide (BN-PAGE) a été développé comme une alternative moins dénaturant à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide-dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE), et permet la séparation de certaines protéines et des complexes à partir d' échantillons biologiques ^7. Cependant, les protéines dans la base BN-PAGE séparent sur un large nombre de variables, y compris la taille, la charge, la structure en trois dimensions, et l'association avec d'autres molécules. Les interactions de ces facteurs se traduisent souvent par co-séparation des protéines, la formation d'agrégats, et une mauvaise résolution de la bande de protéine. Électrophorèse bidimensionnelle sur gel natif de polyacrylamide résout certains, mais pas tous, de ces problèmes ^8.

Pour éviter les complications associées à la séparation native, certains auteurs utilisent des réactifs de reticulation réactifs avec les amines, telles que dithiobis (propionate de succinimidyle) (DSP), pour capturer des complexes protéiques dans les lysats de tissu ^4. Ces lysats traités peuvent ensuite être dénaturés et séparés par SDS-PAGE, tout en conservant la taille native et le maquillage des complexes de protéines. Cependant, étant donné que les réactifs de réticulation réagissent en fonction de la proximité d'une molécule à l'autre, et les protéines dans les lysats de tissus ont beaucoup de degrés de liberté et peut interagir stochastiquement, croix de fond non spécifique-linking peut être élevé, en particulier dans les échantillons concentrés. Cela peut conduire à des résultats difficiles à interpréter.

Ici, nous démontrons l'utilisation d'un procédé hybride BN-PAGE / SDS-PAGE, appelée électrophorèse sur gel de polyacrylamide-multimère (multimère-PAGE), pour séparer et détecter des assemblages de protéines dans des mélanges complexes. Dans un premier temps, le lysat cellulaire est mis en suspension dans un gel de polyacrylamide via BN-PAGE. Le gel contenant de l'lysat est ensuite mis à réagir avec le réactif de réticulation DSP. Pseudo-immobilisé et légèrement séparés sur le gel, les protéines sont beaucoup moins susceptibles de réagir de façon non spécifique, ce qui signifie fond réactivité de réticulation est réduite. Après la reticulation, les bandes de gel sont excisées et séparées par SDS-PAGE. Le gel obtenu peut être ensuite analysé par tout moyen généralement associés à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Cette méthode permet la séparation et la détection des complexes de protéines natives dans un lysat de tissu non modifié, sans la nécessité d'une purification supplémentaire ou pull-down.

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Protocole

1. Préparation du tissu

1. Préparer 10 ml de 4x tampon d'échantillon BN-PAGE (200 mM de bis (2-hydroxyéthyl) amino-tris (hydroxyméthyl) méthane (Bis-Tris), 200 mM de NaCl, 40% p / v de glycerol, 0,004% de Ponceau S, pH 7,2 ).
   NOTE: Cette solution mère peut être faite à l'avance et conservé à 4 ° C.
2. Diluer 250 ul de tampon d'échantillon 4x dans 750 ul dH ₂ O contenant un cocktail d'inhibiteurs de proteases commerciales 1x. Vortex et laisser refroidir sur la glace.
3. Homogénéiser 20 mg de tissu cible dans le 1 mL 1x glacée tampon d'échantillon BN-PAGE avec 30 coups d'un homogénéisateur Dounce propre.
   NOTE: Pour cette expérience de démonstration, le tissu cible est l'ensemble des tissus du cerveau de rat. Après homogénéisation, les échantillons peuvent être traités avec un détergent doux tel que 2% de digitonine pour solubiliser et permettre l'électrophorèse des protéines de la membrane.
4. Transférer le broyat dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml, et centrifuger à 14 000 xg pendant 30 min pour sédimenter contenus cellulaires insolubles. AFTEcentrifugation r, décanter le surnageant dans un tube propre sur la glace.
5. Suivre les instructions du fabricant pour mesurer la concentration de protéine surnageant en utilisant l'acide bicinchoninique (BCA) ou une analyse de protéine de quantification similaire.
6. Si l'échantillon d'homogénat (s) contient un détergent, ajouter une quantité de 5% de bleu de Coomassie G-250 en solution aqueuse suffisante pour amener la solution d'homogénat à 0,25% de Coomassie.

2. BN-PAGE

1. Diluer 25 ml 20x native bleu (BN) électrophorèse stock tampon (1,0 M Bis-Tris, 1,0 M tricine, pH 6,8) dans 475 ml de dH ₂ O contenant 0,002% de bleu de Coomassie pour faire 500 ml de 1 x tampon de migration.
   1. Si les échantillons contiennent du détergent, à la place faire 250 ml de tampon de migration 1x contenant 0,02% de Coomassie et 250 mL contenant aucun.
2. tampon Chill (s) à 4 ° C.
3. Nettoyer et assembler une cassette de coulée du gel de polyacrylamide selon les instructions du fabricant.
4. Pour gel de polyacrylamide BN (3% T couche d'empilement, 6% T couche de résolution) selon une recette de référence ^7, et placer le peigne de puits.
5. Après que les gels ont polymérisé, rincer la cassette avec dH ₂ O et d' assembler l'appareil d'électrophorèse selon les instructions du fabricant.
6. Retirez le bien peigne et remplir les puits avec 1x tampon de fonctionnement BN-PAGE. Éviter de remplir la totalité de la chambre intérieure avec un tampon jusqu'à ce que les échantillons sont chargés.
   1. Si les échantillons contiennent du détergent, remplir les puits avec le tampon contenant 0,02% de bleu de Coomassie.
      REMARQUE: Effectuez les étapes 2/7 à 2/9 à 4 ° C.
7. En utilisant des pointes de chargement de gel, une pipette d'un volume d'homogénat contenant 20 ug de protéine dans les puits souhaités. Pipeter un volume équivalent de tampon d'échantillon 1x BN-PAGE dans des puits non utilisés.
   REMARQUE: Utiliser la concentration en protéine déterminée à partir du dosage BCA pour calculer le volume approprié de l'homogénat à ajouter àles puits.
8. Après échantillons sont chargés, remplir la chambre intérieure avec un tampon de course 1x BN-PAGE. Assurez - vous que le gel est entièrement immergé dans un tampon. Ensuite, remplir la chambre externe avec un tampon de course 1x au niveau indiqué par le constructeur.
   1. Si les échantillons contiennent du détergent, remplir la chambre intérieure avec le tampon 1x contenant 0,02% de bleu de Coomassie, et la chambre extérieure avec un tampon en cours d'exécution 1x sans colorant.
9. Connecter les électrodes à l'alimentation électrique, et l'électrophorèse des protéines dans le gel à 150 V jusqu'à ce que la bande de colorant progresse ~ 2 cm dans la résolution de couche. Arrêtez et débranchez l'alimentation.

3. La réticulation

REMARQUE: Effectuez les étapes 03.01 à 03.06 à 4 ° C.

1. Désassembler l'appareil d'électrophorèse, et à séparer les panneaux de verre de la cassette de gel. Retirez et jetez la couche d'empilement.
2. Couper avec soin le gel juste en dessous du bord inférieur de la face de colorant. PrendreVeillez à ce que cette coupe soit aussi lisse et droite que possible, puis jettez le morceau de gel non utilisé. Cela laissera une bande horizontale de gel de polyacrylamide de ~ 2 cm de large, qui contiendra toutes les protéines dans l'échantillon homogénat.
3. Découper toutes les portions inutilisées le long des bords de la bande de gel.
4. Placez soigneusement la bande dans 10 mL de solution salée tamponnée au phosphate (PBS) dans un petit récipient et mélangez délicatement par nutation pendant 30 minutes pour équilibrer.
5. Après équilibrage, jeter et remplacer le PBS par 10 mL supplémentaires. Pipetter 500 μL de DSP 25 mM dissous dans du diméthylsulfoxyde dans le PBS et continuer à mélanger comme ci-dessus (étape 3.4) pendant 30 min.
6. Verser la solution DSP. Ajouter 10 ml de chlorhydrate de tris (hydroxyméthyl) aminométhane 0,375 M (Tris-HCl), pH 8,8, contenant 2% de dodécylsulfate de sodium (SDS) pour étancher le DSP n'ayant pas réagi. Continuer la nutation pendant 15 min.

4. SDS-PAGE

1. Alors que la bande de gel trempe, prépare SDS-PASolutions de gel GE selon des méthodes standard ^9. Ne pas ajouter des réactifs de polymérisation.
2. Après la trempe, le retour de la bande de gel ΒΝ à la température ambiante, et la bande coulée dans une nouvelle cassette de gel.
   1. Pour ce faire, choisissez soigneusement le gel et le placer sur une plaque d'espacement de cassette de gel propre.
   2. Orient la bande de sorte que le fond du front de colorant est la plus proche de la partie supérieure de cassette ( à savoir le côté qui a voyagé le plus loin au cours de BN-PAGE devrait être plus proche de la partie supérieure de la nouvelle cassette, la bande de gel doit être retourné à partir de son avant orientation). Voir la figure 3.
   3. Placer la bande de telle sorte que son bord supérieur se trouve même où le bord supérieur de la plaque de recouvrement sera ( à savoir, il sera dans le haut du nouveau gel). Assurez-vous que le front de colorant est parallèle aux bords horizontaux de la plaque de verre.
   4. Appuyez sur une face de la bande excisée contre l'une des parois d'entretoise, laissant la place à til autre côté pour le gel à couler et à un niveau de protéine ou une échelle à charger.
   5. Si le bord inférieur de la bande de gel contient des zones crénelés ou inégaux, les couper à une distance soigneusement. Le cas échéant, ils bulles piège lors de la coulée du gel.
   6. Une fois que la bande de gel est positionnée correctement, fixer la plaque de recouvrement au-dessus de la plaque d'espacement. Appliquer une légère pression pour pousser les bulles d'air piégées.
   7. Continuer d'assembler l'appareil de coulage de gel conformément aux instructions du fabricant.
3. Ajouter des réactifs de polymérisation dans le tampon de gel de résolution, et le verser dans la cassette de gel préparé, en utilisant une pipette sérologique. Remplir la cassette de gel de ~ 2 cm au-dessous de la bande de gel excisée BN-PAGE, afin de laisser la place à la couche d'empilement.
4. Ajouter 100 pL de butanol sur le dessus du gel coulé, et laisser 30 min pour la polymérisation de la couche de résolution. Décanter le butanol.
5. Ajouter des réactifs de polymérisation à la solution de gel d'empilement. L' utilisation d' un serologpipette ical, verser la couche d'empilement pour remplir tout l'espace vide restant dans la cassette de gel.
   1. Incliner la cassette de gel en tant que couche d'empilement est versée afin de remplir l'espace au-dessous de la bande de gel, et des bulles d'air ne sont pas pris au piège.
   2. Comme le tampon de gel d'empilement remplit l'espace vide en dessous de la bande de gel, retourner progressivement la cassette de gel au pied de niveau.
   3. Continuer de remplir l'espace vide à côté de la bande de gel excisée avec le tampon de gel d'empilement, jusqu'à ce qu'il déborde à peu près.
6. Laisser la couche d'empilement pour polymériser pendant 30 minutes.
   REMARQUE: Faire un tampon en cours d'exécution 10x SDS-PAGE (250 mM de tris (hydroxyméthyl) aminométhane (tris), de la glycine 1,9 M, SDS 1%), tandis que le gel est la polymérisation. Cela peut aussi être fait à l'avance et conservé à température ambiante.
7. Diluez 50 mL 10X stock tampon de fonctionnement SDS-PAGE dans 450 ml dH ₂ O pour faire tampon de travail 1x.
8. Après que la couche d'empilement est polymérisé, retirer la cassette de gel de la couléeAppareil, rincer avec dH ₂ O, et assembler l'appareil d'électrophorèse selon les instructions du fabricant.
9. Remplir complètement la chambre intérieure avec un tampon de course 1x SDS-PAGE, puis remplir la chambre extérieure au niveau indiqué par le constructeur.
10. Charger l'espace à côté de la bande de gel excisée avec une échelle de poids moléculaire ou de la norme de protéine appropriée.
11. Attacher les électrodes à l'alimentation électrique, et l'électrophorèse des échantillons à 120 V. Lorsque le colorant Coomassie coule le gel, arrêter et couper l'alimentation électrique.
12. Analyse du gel en utilisant des procédés standard de détection et électrotransfert des protéines par liaison de l' anticorps ^10.

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Résultats

Dans cette expérience de démonstration, multimère-PAGE a été réalisée sur l'ensemble lysat de cerveau de rat. Les protéines séparées résultantes ont été transférées sur des membranes de difluorure de polyvinylidène (PVDF), et ensuite sondées avec des anticorps dirigés contre des protéines qui sont connues pour former des complexes. La figure 1 montre une validation du protocole par deux moyens. Tout d' abord, nous avons démontré que les prot?...

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Discussion

Les interactions protéine-protéine sont importantes pour tous les êtres vivants réalisent la tâche. En raison de cela, ils font l'objet d'un examen minutieux et de la recherche. Multimère-PAGE est un nouveau procédé pour la saisie, la séparation et l'analyse d'une large gamme de complexes de protéines. Nous avons déjà démontré son applicabilité à l' étude oligimerization de la protéine associée à la maladie α-synucléine ^11. Cependant, il est extensible à...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
ε-Aminocaproic acid	Sigma	A2504
Acrylamide	Acros Organics	164855000	Toxic.
Acrylamide/bisacrilamide 37.5:1 (40%T stock solution)	BioRad	161-0148	Toxic.
Ammonium persulfate	Sigma	A3678
Anti rabbit IgG-HRP from goat	Santa Cruz Biotechnology	sc-2004
Bicinchoninic acid assay kit	Thermofisher	23225
Bis-tris	Sigma	B9754
Bovine serum albumin	Sigma	A9647
Butanol	Fisher Scientific	A399-1
Chemiluminescence substrate kit	ThermoFisher	24078
Coomassie blue G-250	Sigma-Aldrich	B0770
Digitonin	Sigma	D141	Toxic.
Dimethyl sulfoxide	Fisher Scientific	D128-1
Dithiobis(succinimidylpropionate)	Thermo Scientific	22585
Dry nonfat milk	LabScientific	M0841
Glycerol	Sigma	G9012
Glycine	Fisher Scientific	BP381-5
Halt Protease Inhibitor Cocktail	Thermofisher	78430
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A144SI-212	For titration. Caustic.
Methanol	Fisher Scientific	A412-4	For PVDF membrane activation. Toxic.
Monoclonal anti α-synuclein IgG from rabbit	Santa Cruz Biotechnology	sc-7011-R
N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine	Sigma	T9281
N,N'-methylenebisacrylamide	Acros Organics	16479	Toxic.
NP40	Boston Bioproducts	P-872
Polysorbate 20 (tween-20)	Fisher Scientific	BP337-500
Polyvinylidene fluoride transfer membranes	Thermo Scientific	88518
Ponceau S	Sigma	P3504
Potassium chloride	Fisher Scientific	P217-3
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P9791
Protease inhibitor cocktail	Thermo Scientific	88265
SDS solution (10% w/v)	BioRad	161-0416
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-212
Sodium dodecyl sulfate	Sigma	L37771
Sodium phosphate monobasic	Fisher Scientific	BP329-1
Tricine	Sigma	T0377
Tris base	Fisher Scientific	BP152-500
Tris-HCl (0.5 M buffer, pH 6.8)	BioRad	161-0799
Tris-HCl (1.5 M buffer, pH 8.8)	BioRad	161-0798
Name	Company	Catalog Number	Comments
Instruments
GE Imagequant LAS 4000	GE Healthcare	28-9558-10
ImageJ software	NIH
Synergy H1 microplate reader	BioTek
Gel Former + Stand	Biorad
Microfuge 22R centrifuge	Beckman Coulter
2 mL dounce homogenizer
Vortex mixer	Fisher Scientific
Ultrasonic tissue homogenizer	Fisher Scientific	FB120220