多量-PAGE：生体試料中のキャプチャと解決タンパク質複合体のための方法

要約

新規二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）システムが提示されるに結合アミン反応性タンパク質架橋剤を用いて修飾されていない組織溶解物から天然タンパク質複合体を安定化し、分離するための方法。

要約

単一タンパク質やペプチドを精製し、研究するための多くのよく開発された方法があります。しかし、ほとんどの細胞機能は、それらの結合は、非共有結合および精製技術により、容易に乱されるので、多くの場合、調査が困難であるタンパク質複合体の相互作用のネットワークによって行われます。この作業は、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて修飾されていない組織から天然タンパク質複合体を安定化し、分離する方法を記載しています。組織溶解物は、タンパク質がゲルに短い距離を移動するまで、電流が印加され、非変性ブルーネイティブポリアクリルアミドゲル上にロードされています。移行されたタンパク質を含むゲルストリップは、次いで、切除し、共有結合タンパク質複合体を安定化アミン反応性架橋試薬ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）、と共にインキュベートします。架橋複合体を含有するゲルストリップは、次いでドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルにキャストされ、そしてT彼複合体が完全に分離されています。この方法は、それが安価で習得が容易であることを意味、技術と最も分子生物学者になじみの材料に依存しています。それは十分に非常に大きな複合体を分離する能力が制限され、かつ普遍的に成功していないものの、この方法は、十分に研究された複合体の多種多様をキャプチャすることができた、と関心の多くのシステムに可能性が適用されます。

概要

正常な細胞機能は、タンパク質-タンパク質相互作用^1、2に依存しています。その結果、ヒトの疾患は、しばしば、種々のタンパク質複合体³の組立及び動作の摂動によってマークされます。このような相互作用を特徴付ける能力は極めて重要です。これらの相互作用を検出するための現在の手段は、多くの場合、それらの相互作用パートナーのプルダウンに続いて、標的タンパク質の精製を必要としています。従来の精製は、分画遠心分離、沈殿、及び/又はクロマトグラフィー⁴によって達成されます。これらの方法は、時間がかかる各標的タンパク質のために変更しなければならない、としばしば低い収率につながります。近代的な精製法は^、捕捉分子⁵に結合されたビーズを搭載したカラム上の免疫沈降または抽出し、タンパク質をターゲットにするペプチドタグの融合を伴いますこれは多くのタンパク質に拡張可能であるが「> 6。、それは潜在的にそれらの通常の結合パートナーに対する親和性の異なる構築物をもたらす、標的の配列の改変を必要とする。いくつかのタンパク質-タンパク質相互作用の微妙な性質は、この方法が適用できない場合があり手段多くのシナリオである。さらに、タンパク質 - タンパク質相互作用をマッピングするために使用されるプルダウンアッセイは、制限された自由度とベイトタンパク質の非天然レベルに起因する正確な細胞画像を、キャプチャしないことができます。

理想的には、タンパク質複合体は、精製またはプルダウンを必要とせず、その天然状態で検出することができました。ブルーネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（BN-PAGE）をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）にあまり変性の代替として開発され、そして生物学的サンプル⁷からのいくつかのタンパク質との複合体の分離を可能にしました。しかし、BN-PAGE中のタンパク質は、LARに基づいて分離しますサイズ、電荷、立体構造、および他の分子との会合を含む変数のGE番号。これらの要因の相互作用は、多くの場合、タンパク質の同時分離、凝集体形成、および不十分なタンパク質バンドの解像度をもたらします。二次元ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動は、いくつかを解決し、すべてではないが、これらの問題⁸の。

天然の分離に関連する合併症を回避するために、何人かの著者は、組織溶解物⁴のタンパク質複合体を捕捉するために、例えばジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）のようなアミン反応性架橋試薬（DSP）を使用します。これらの治療の溶解物は、変性およびタンパク質複合体の本来のサイズと化粧を維持しながら、SDS-PAGEによって分離することができます。しかしながら、架橋試薬ので、別の分子の近接性に基づいて、および組織溶解物中のタンパク質は、多くの自由度を有し、確率的に相互作用することができ、非特異的バックグラウンドの交差反応特に濃縮したサンプルでは、​​リンカーが高くなります。これは解釈が難しい結果につながる可能性があります。

ここでは、複合体混合物中のタンパク質集合体を分離および検出するために、マルチマー - ポリアクリルアミドゲル電気泳動（マルチマー-PAGE）と呼ばれるハイブリッドBN-PAGE / SDS-PAGE法の使用を実証する。最初に、細胞溶解物をBN-PAGEを介してポリアクリルアミドゲルに懸濁する。次いで、溶解物含有ゲルを架橋試薬DSPと反応させる。疑似的に固定化され、ゲル上でわずかに分離された場合、タンパク質は非特異的に反応する可能性が低くなり、バックグラウンドの架橋剤の反応性が低下する。架橋後、ゲルバンドを摘出し、SDS-PAGEにより分離する。次いで、得られたゲルを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に典型的に関連する任意の手段によって分析することができる。この方法は、未精製の組織ライセート中の天然タンパク質複合体の分離および検出を可能にし、追加の精製またはプルダウを必要としないn個。

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プロトコル

1.組織調製

1. 4X BN-PAGE試料緩衝液（200mMのビス（2-ヒドロキシエチル）アミノ - トリス（ヒドロキシメチル）メタン（BIS-TRIS）の10mLの、200mMのNaCl、40％のw / vのグリセロール、0.004％ポンソーS、pHが7.2を準備）。
   注：このストック溶液は、事前に行われ、4℃で保存することができます。
2. 1×商用プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む750μLのdH ₂ Oで4倍のサンプルバッファー250μLに希釈します。ボルテックスし、氷上で寒さ。
3. クリーンダウンスホモジナイザーの30ストロークで1 mLの1Xの氷冷BN-PAGEサンプル緩衝液中に標的組織20mgを均質化します。
   注：この実証実験では、標的組織が全体のラットの脳組織です。均質化の後、試料を可溶化した膜タンパク質の電気泳動を可能にするために、中性洗剤等の2％ジギトニンで処理してもよいです。
4. 1.5mLのマイクロ遠心チューブにホモジネートを転送し、そして不溶性の細胞内容物をペレット化するために30分間、14,000×gで遠心分離。 AFTERの遠心分離は、氷の上にきれいなチューブに上清をデカント。
5. ビシンコニン酸（BCA）または類似のタンパク質定量アッセイを用いて上清のタンパク質濃度を測定するために、製造業者の指示に従います。
6. ホモジネート試料（単数または複数）が、界面活性剤が含まれている場合、0.25％クマシーにホモジネート溶液をもたらすのに十分な、水溶液中の5％クーマシーブルーG-250の量を加えます。

2. BN-PAGE

1. ランニングバッファーを1×500mLのを作るために0.002％クーマシーブルーを含有する475ミリリットルのdH ₂ Oに25 mLの20倍ブルーネイティブ（BN）泳動緩衝液ストック（1.0Mビス-トリス、1.0 Mトリシン、pHが6.8）を希釈します。
   1. サンプルは界面活性剤が含まれている場合、代わりに0.02％クーマシーを含有する1×ランニングバッファー250mLのと何を含まない別の250ミリリットルを加えます。
2. 4°Cまで冷却バッファ（S）。
3. きれいにし、製造者の指示に従ってカセットを注入ポリアクリルアミドゲルを組み立てます。
4. 標準レシピ⁷に記載^の BNポリアクリルアミドゲル（10％Tスタッキング層、6％T解決層）を注ぎ、そしてウェルコームを置き。
5. ゲルが重合した後、のdH ₂ Oを用いてカセットをリンスし、製造者の指示に従って電気泳動装置を組み立てます。
6. ウェルコームを取り外し、1×BN-PAGEランニング緩衝液で井戸を埋めます。サンプルがロードされるまで緩衝液で全内部チャンバを充填避けます。
   1. サンプルは界面活性剤を含む場合は、0.02％クーマシーブルーを含有する緩衝液でウェルを満たします。
      注：4°Cで、手順2.7から2.9を実行します。
7. ゲルローディングチップを用いて、所望のウェルに20μgのタンパク質を含有するホモジネートの体積をピペット。未使用のウェルに1×BN-PAGEサンプル緩衝液の等量をピペット。
   注：に追加したホモジネートの適切な量を計算するためにBCAアッセイから決定されたタンパク質の濃度を使用し井戸。
8. サンプルがロードされた後、1×BN-PAGEランニング緩衝液を用いて、内部チャンバを充填します。ゲルが完全にバッファに沈めていることを確認します。次に、製造者によって示されるレベルに1×ランニングバッファーと外側室を満たします。
   1. サンプルは界面活性剤を含む場合は、0.02％クーマシーブルーを含有する1×緩衝液、及び染料を含まない1×ランニングバッファーと外側チャンバと内部チャンバを充填します。
9. 電源に電極を接続し、染料バンド層を解決するに〜2cmに進行するまで、150 Vでゲル中のタンパク質を電気泳動。停止し、電源を切断します。

3.架橋

注：4°Cで、手順3.1から3.6を実行します。

1. 電気泳動装置を分解し、ゲルカセットのガラス板を分離します。スタッキング層を取り外して捨てます。
2. 注意深くだけ染料前面の下縁下ゲルを切りました。取るこのカットとして滑らかで真っ直ぐとして可能にするように注意し、その後ゲルの未使用部分を捨てます。これは、ホモジネート試料中のすべてのタンパク質が含まれていますポリアクリルアミドゲルの〜2cm幅、水平方向のストリップを、残します。
3. ゲルストリップの縁に沿って任意の未使用部分を切り取ります。
4. 注意深く小さな容器に10mLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中にストリップを配置し、そして穏やかに平衡化する30分間章動によって混合します。
5. 平衡化後、破棄し、別の10 mLのPBSに置き換えます。ピペット500μLの25mM DSPはPBSにジメチルスルホキシドに溶解し、そして30分間、上記のように（ステップ3.4）混合を続けます。
6. DSP溶液をオフに注ぎます。未反応のDSPをクエンチするために、2％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含む0.375 Mトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（トリス-HCl）、pHが8.8の10ミリリットルを加えます。 15分間章動を続行します。

4. SDS-PAGE

1. ゲルストリップが急冷されている間、SDS-PAを準備標準的な方法⁹に従ってGEゲル溶液。重合試薬を追加しないでください。
2. 急冷した後、室温にΒΝゲルストリップを返し、新しいゲルカセットの中にストリップをキャスト。
   1. これを行うには、慎重にゲルをピックアップし、クリーンゲルカセットのスペーサプレートの上に置きます。
   2. オリエントストリップ色素フロントの底部（ 即ち 、BN-PAGE中に遠くに移動側は新たなカセットの上部に最も近いなければならない新たなカセットの上部に最も近いので、ゲルストリップは、その前から反転されなければなりませんオリエンテーション）。 図3を参照してください。
   3. その上縁があっても、カバープレートの上端がされる場所であるようにストリップを配置する（ すなわち 、それは新たなゲルの上部にあるであろう）。色素の先端がガラス板の水平エッジに平行であることを確認します。
   4. トンの余地を残し、スペーサ壁の一つに対して切除されたストリップの一方の側を押してくださいゲルのために彼の他の側面を注入すると、タンパク質の標準またはラダーをロードします。
   5. ゲルストリップの下端は、任意のギザギザや不均一な領域が含まれている場合は、慎重にそれらを切り取ります。存在する場合、それらは、ゲル中にトラップ気泡が注ぐだろう。
   6. ゲルストリップが正しく配置されると、スペーサプレートの上にカバープレートを置きます。閉じ込められた気泡を押し出すために穏やかな圧力を適用します。
   7. 製造業者の指示に従ってゲル注入装置を組み立てるために続けます。
3. 分離ゲル緩衝液に重合試薬を追加し、及び血清学的ピペットを使用して、調製したゲルカセットにそれを注ぎます。スタッキング層のための余地を残すために、切除したBN-PAGEゲルストリップ下の約2 cmのゲルカセットを記入してください。
4. 注ぎゲルの上に100μLのブタノールを追加し、解決層の重合のために30分を許可します。ブタノールをオフに注ぎます。
5. スタッキングゲル溶液に重合試薬を追加します。 serologを使用してiCalのピペット、ゲルカセット内の残りのすべての空のスペースを埋めるためにスタッキング層を注ぎます。
   1. それはゲルストリップの下の空間を満たすように、スタッキング層が注がれ、気泡がトラップされないようにゲルカセットを傾けます。
   2. スタッキングゲル緩衝液はゲルストリップの下の空のスペースを埋めるように、徐々にレベル足場にゲルカセットを返します。
   3. ほぼオーバーフローそれまでは、次のスタッキングゲル緩衝液を用いて切り出したゲルストリップに空きスペースを埋めるために続けます。
6. スタッキング層は、30分間重合することができます。
   注：ゲルが重合されている間10×SDS-PAGEのランニング緩衝液（250mMのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（TRIS）、1.9 Mグリシン、1％SDS）を作ります。これはまた、予め作られ、室温で保存することができます。
7. 1xの作業バッファを作るために450ミリリットルのdH ₂ Oに50 mLの10倍のSDS-PAGEランニングバッファーの株式を希釈します。
8. スタッキング層が重合した後、注入からゲルカセットを除去装置は、のdH ₂ Oでリンスし、そして製造者の指示に従って電気泳動装置を組み立てます。
9. 次いで、製造業者によって示されるレベルに外側チャンバを満たす、1×SDS-PAGEのランニング緩衝液で完全に内部チャンバを充填します。
10. 次分子量ラダーまたは適切なタンパク質標準で切り出し、ゲルストリップにスペースをロードします。
11. 電源に電極を取り付け、そしてクマシー色素がゲルをオフに実行すると120 V.でサンプルを電気泳動、停止して電源を切断します。
12. ^10結合抗体によるエレクトロ及びタンパク質検出の標準的な方法を用いてゲルを分析します。

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結果

この実証実験では、多量-PAGEは、全ラット脳溶解液で行われました。得られた分離されたタンパク質をポリビニリデンジフルオリド（PVDF）膜にブロットし、次いで複合体を形成することが知られているタンパク質に対する抗体でプローブしました。 図1は、2つの手段によってプロトコルの検証を示します。まず、架橋されたタンパク質が観察されたより?...

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ディスカッション

タンパク質間相互作用は、生き物が行っすべてのタスクのために重要です。このため、彼らは厳しい調査と研究の対象となっています。多量-PAGEは、捕捉分離、およびタンパク質複合体の広い範囲を分析するための新規な方法です。我々は以前に疾患関連タンパク質のαシヌクレイン¹¹のoligimerizationを研究への適用可能性を実証しています。しかし、 図2に示され...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
ε-Aminocaproic acid	Sigma	A2504
Acrylamide	Acros Organics	164855000	Toxic.
Acrylamide/bisacrilamide 37.5:1 (40%T stock solution)	BioRad	161-0148	Toxic.
Ammonium persulfate	Sigma	A3678
Anti rabbit IgG-HRP from goat	Santa Cruz Biotechnology	sc-2004
Bicinchoninic acid assay kit	Thermofisher	23225
Bis-tris	Sigma	B9754
Bovine serum albumin	Sigma	A9647
Butanol	Fisher Scientific	A399-1
Chemiluminescence substrate kit	ThermoFisher	24078
Coomassie blue G-250	Sigma-Aldrich	B0770
Digitonin	Sigma	D141	Toxic.
Dimethyl sulfoxide	Fisher Scientific	D128-1
Dithiobis(succinimidylpropionate)	Thermo Scientific	22585
Dry nonfat milk	LabScientific	M0841
Glycerol	Sigma	G9012
Glycine	Fisher Scientific	BP381-5
Halt Protease Inhibitor Cocktail	Thermofisher	78430
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A144SI-212	For titration. Caustic.
Methanol	Fisher Scientific	A412-4	For PVDF membrane activation. Toxic.
Monoclonal anti α-synuclein IgG from rabbit	Santa Cruz Biotechnology	sc-7011-R
N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine	Sigma	T9281
N,N'-methylenebisacrylamide	Acros Organics	16479	Toxic.
NP40	Boston Bioproducts	P-872
Polysorbate 20 (tween-20)	Fisher Scientific	BP337-500
Polyvinylidene fluoride transfer membranes	Thermo Scientific	88518
Ponceau S	Sigma	P3504
Potassium chloride	Fisher Scientific	P217-3
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P9791
Protease inhibitor cocktail	Thermo Scientific	88265
SDS solution (10% w/v)	BioRad	161-0416
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-212
Sodium dodecyl sulfate	Sigma	L37771
Sodium phosphate monobasic	Fisher Scientific	BP329-1
Tricine	Sigma	T0377
Tris base	Fisher Scientific	BP152-500
Tris-HCl (0.5 M buffer, pH 6.8)	BioRad	161-0799
Tris-HCl (1.5 M buffer, pH 8.8)	BioRad	161-0798
Name	Company	Catalog Number	Comments
Instruments
GE Imagequant LAS 4000	GE Healthcare	28-9558-10
ImageJ software	NIH
Synergy H1 microplate reader	BioTek
Gel Former + Stand	Biorad
Microfuge 22R centrifuge	Beckman Coulter
2 mL dounce homogenizer
Vortex mixer	Fisher Scientific
Ultrasonic tissue homogenizer	Fisher Scientific	FB120220