Multímero-PAGE: Un método para capturar y Proteína Resolver Complejos en muestras biológicas

Resumen

Un método para estabilizar y separar los complejos de proteínas nativas de lisado de tejido no modificado utilizando un proteína reticulante reactivo con amina acoplada a una novela de dos dimensiones electroforesis en gel de poliacrilamida se presenta sistema (PAGE).

Resumen

Hay muchos métodos bien desarrollados para la purificación y el estudio de proteínas individuales y péptidos. Sin embargo, la mayoría de las funciones celulares se llevan a cabo por las redes de interacción complejos de proteínas, que son a menudo difíciles de investigar debido a que su unión es no covalente y fácilmente perturbado por técnicas de purificación. Este trabajo describe un método de estabilización y separación de los complejos de proteínas nativas a partir de tejido no modificado usando electroforesis en gel de poliacrilamida bidimensional. lisado de tejido se carga en un gel de poliacrilamida azul-nativo no desnaturalizante, a continuación, se aplica una corriente eléctrica hasta que la proteína migra una corta distancia en el gel. La tira de gel que contiene la proteína migrado después se escinde y se incubó con los ditiobis de amina reactiva reticulantes reactivos (succinimidil propionato), que estabiliza covalentemente complejos de proteínas. La tira de gel que contiene complejos reticulados se moldea a continuación en un gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio, y tél complejos se separan por completo. El método se basa en técnicas y materiales familiares para la mayoría de los biólogos moleculares, lo que significa que es barato y fácil de aprender. A pesar de que está limitado en su capacidad para separar adecuadamente los complejos extremadamente grandes, y no ha sido universalmente exitosa, el método fue capaz de capturar una amplia variedad de complejos bien estudiados, y es probable aplicable a muchos sistemas de interés.

Introducción

La función celular normal depende de interacciones proteína-proteína ^{1, 2.} Como resultado, las enfermedades humanas son a menudo marcadas por las perturbaciones en el montaje y comportamiento de varios complejos de proteínas ^3. La capacidad de caracterizar tales interacciones es por lo tanto crítico. medios actuales de detección de estas interacciones requieren la purificación de proteínas diana, a menudo seguidas por desplegable de sus socios que interactúan. Convencionales de purificación se lleva a cabo por centrifugación diferencial, precipitación y / o cromatografía ^4. Estos métodos son mucho tiempo, deben ser alterados para cada proteína diana, y a menudo resultan en bajos rendimientos. Métodos de purificación modernos implican la fusión de etiquetas peptídicas a proteínas diana, seguido por inmunoprecipitación o extracción en columnas cargadas con perlas unidas a una molécula de captura ^5,"> 6. Si bien esto es extensible a muchas proteínas, se requiere modificación de la secuencia de la diana, potencialmente resultando en construcciones que difieren en afinidad por sus parejas de unión habituales. La delicada naturaleza de algunas interacciones proteína-proteína significa este método puede no ser aplicable a muchos escenarios. Además, las pull-down ensayos usados ​​para mapear las interacciones proteína-proteína pueden no capturar una imagen precisa celular, debido a los grados de libertad restringidos y los niveles no nativos de la proteína cebo.

Idealmente, los complejos de proteínas podrían ser detectados en sus estados nativos, sin la necesidad de purificación o pull-down. Electroforesis en gel de poliacrilamida nativo azul (BN-PAGE) se desarrolló como una alternativa menos desnaturalizante a electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE), y permite la separación de algunas proteínas y complejos de muestras biológicas ^7. Sin embargo, las proteínas en BN-PAGE separado basado en un larnúmero ge de variables, incluyendo el tamaño, carga, estructura tridimensional, y la asociación con otras moléculas. Las interacciones de estos factores a menudo resultan en co-separación de proteínas, la formación de agregados, y una pobre resolución banda de proteína. Electroforesis en gel de poliacrilamida nativo de dos dimensiones resuelve algunos, pero no todos, de estos problemas ^8.

Para evitar las complicaciones asociadas con la separación nativa, algunos autores utilizan reactivos de amina reactiva de reticulación, tales como ditiobis (propionato de succinimidilo) (DSP), para capturar complejos de proteínas en lisados de tejido ^4. Estos lisados ​​tratados a continuación, se pueden desnaturalizar y se separaron por SDS-PAGE, mientras que preserva el tamaño nativo y maquillaje de complejos de proteínas. Sin embargo, ya que los reactivos de reticulación reaccionan basa en la proximidad de una molécula a otra, y las proteínas en los lisados ​​de tejido tienen muchos grados de libertad y estocásticamente puede interactuar, cruz fondo no específica-linking puede ser alto, especialmente en muestras concentradas. Esto puede conducir a resultados difíciles de interpretar.

Aquí, demostramos el uso de un método híbrido BN-PAGE / SDS-PAGE, denominado electroforesis en gel de poliacrilamida-multímero (multímero-PAGE), para separar y detectar los conjuntos de proteínas en mezclas complejas. Inicialmente, lisado de células se suspende en gel de poliacrilamida a través de BN-PAGE. El gel que contiene lisado se hace reaccionar luego con el DSP reactivo de reticulación. Pseudo-inmovilizado y ligeramente separadas en el gel, las proteínas son mucho menos propensos a reaccionar de manera no específica, lo que significa reactividad fondo reticulante se reduce. Después de la reticulación, las bandas de gel se extirpan y se separó a través de SDS-PAGE. El gel resultante se puede analizar entonces por cualquier medio típicamente asociados con electroforesis en gel de poliacrilamida. Este método permite la separación y la detección de complejos de proteínas nativas en lisado de tejido sin modificar, sin la necesidad de purificación adicional o pull-downorte.

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Protocolo

1. Preparación del tejido

1. Preparar 10 ml de 4x tampón de muestra BN-PAGE (Bis 200 mM (2-hidroxietil) amino-tris (hidroximetil) metano (Bis-Tris), NaCl 200 mM, 40% w / v de glicerol, 0,004% Ponceau S, pH 7,2 ).
   NOTA: Esta solución madre se puede hacer de antemano y se almacena a 4 ° C.
2. Diluir 250! L de tampón de muestra 4x en 750! L dH ₂ O que contiene 1x cóctel inhibidor de proteasa comercial. Vortex y se enfría en hielo.
3. Homogeneizar 20 mg de tejido diana en el 1 ml de 1x de hielo frío tampón de muestra BN-PAGE con 30 golpes de un homogeneizador Dounce limpio.
   NOTA: Para este experimento de demostración, el tejido diana es toda tejido cerebral de rata. Después de la homogeneización, las muestras pueden ser tratadas con detergente suave como el 2% de digitonina para solubilizar y permitir la electroforesis de proteínas de membrana.
4. Transferir el homogenado a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, y se centrifuga a 14.000 xg durante 30 min para sedimentar contenidos celulares insolubles. faetr centrifugación, se decanta el sobrenadante en un tubo limpio en hielo.
5. Siga las instrucciones del fabricante para medir la concentración de proteínas sobrenadante utilizando ácido bicinconínico (BCA) o ensayo de cuantificación de proteínas similar.
6. Si la muestra (s) de homogeneizado contiene detergente, añadir una cantidad de 5% de azul de Coomassie G-250 en solución acuosa suficiente para llevar la solución homogeneizado a 0,25% Coomassie.

2. BN-PAGE

1. Diluir 25 ml de 20x nativo azul (BN) Tampón de electroforesis de stock (1,0 M Bis-Tris, 1,0 M de tricina, pH 6,8) en 475 ml dH ₂ O que contiene 0,002% de azul de Coomassie para hacer 500 ml de tampón de ejecución 1x.
   1. Si las muestras contienen detergente, en lugar de hacer 250 ml de tampón de ejecución 1x que contiene 0,02% de Coomassie y otros 250 ml que contienen ninguno.
2. tampón (s) Chill a 4 ° C.
3. Limpiar y montar un gel de poliacrilamida verter casete de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
4. Verter en gel de poliacrilamida BN (3% capa T de apilamiento, 6% T capa resolver) de acuerdo con una receta estándar ^7, y colocar el peine bien.
5. Después de que los geles han polimerizado, enjuague el casete con dH ₂ O y montar el aparato de electroforesis de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
6. Retire el peine bien y llenar los pocillos con 1 x tampón de ejecución BN-PAGE. Evitar llenar toda la cámara interior con tampón hasta que las muestras se cargan.
   1. Si las muestras contienen detergente, llenar los pocillos con el tampón que contiene 0,02% de azul de Coomassie.
      NOTA: Realice los pasos 2.7 a 2.9 a 4 ° C.
7. Utilizando puntas de carga de gel, una pipeta un volumen de homogeneizado que contiene 20 g de proteína en los pocillos deseados. Pipeta de un volumen equivalente de tampón de muestra 1x BN-PAGE en cualquier pocillos no utilizados.
   NOTA: Utilice la concentración de proteína determinada a partir del ensayo de BCA para calcular el volumen apropiado de homogeneizado para añadir alos pozos.
8. Después las muestras se cargan, llenar la cámara interior con tampón 1x BN-PAGE en marcha. Asegúrese de que el gel se sumergió por completo en tampón. A continuación, llenar la cámara exterior con tampón 1x funcionamiento hasta el nivel indicado por el fabricante.
   1. Si las muestras contienen detergente, llenar la cámara interior con el tampón 1x que contiene 0,02% de azul de Coomassie, y la cámara exterior con tampón de ejecución 1x libre de tinte.
9. Conectar los electrodos a la fuente de alimentación, y a electroforesis las proteínas en el gel a 150 V hasta que la banda colorante avanza ~ 2 cm en la solución de capa. Parar y desconectar la fuente de alimentación.

3. El entrecruzamiento

NOTA: Realice los pasos 3.1 a 3.6 a 4 ° C.

1. Desmontar el aparato de electroforesis, y separar los cristales del casete de gel. Retirar y desechar la capa de apilamiento.
2. Corte cuidadosamente el gel justo por debajo del borde inferior de la frente de colorante. Tomarcuidado para hacer este corte tan lisa y recta posible, y luego desechar la pieza no utilizada de gel. Esto dejará una ~ 2 cm de ancho, franja horizontal de gel de poliacrilamida, que contendrá toda la proteína en la muestra de homogeneizado.
3. Recorte las porciones no utilizadas a lo largo de los bordes de la tira de gel.
4. Con cuidado, coloque la tira en 10 ml solución salina tamponada con fosfato (PBS) en un pequeño recipiente, y mezclar suavemente por nutación durante 30 min para equilibrar.
5. Después de la equilibración, desechar y sustituir el PBS con otros 10 mL. Pipetear 500 l de 25 mM DSP disolvió en sulfóxido de dimetilo en la PBS, y continuar mezclando como anteriormente (etapa 3.4) durante 30 min.
6. Retirar la solución DSP. Añadir 10 ml de 0,375 M de tris (hidroximetil) aminometano clorhidrato (Tris-HCl), pH 8,8, que contienen 2% de dodecilsulfato sódico (SDS) para extinguir el DSP sin reaccionar. Continuar nutación durante 15 min.

4. SDS-PAGE

1. Mientras tira de gel se temple, preparar SDS-PASoluciones de gel de GE acuerdo con métodos estándar ^9. No añadir reactivos de polimerización.
2. Después de inactivar, devuelva la tira de gel ΒΝ a temperatura ambiente, y emitir la tira en una nueva casete de gel.
   1. Para ello, recoger cuidadosamente el gel y colocarlo en una placa espaciadora casete de gel limpia.
   2. Orient la tira por lo que la parte inferior de la frente de colorante es la más cercana a la parte superior de nuevo casete (es decir, el lado que viajó más lejos durante BN-página debe estar más cerca de la parte superior de la nueva casete; la tira de gel debe ser volteado de su previa orientación). Véase la Figura 3.
   3. Coloque la tira de tal manera que su borde superior se encuentra incluso con el lugar donde va a ser el borde superior de la placa de cubierta (es decir, será en la parte superior de la nueva gel). Asegúrese de que el frente de colorante es paralela a los bordes horizontales de la placa de vidrio.
   4. Empuje un lado de la tira extirpado contra una de las paredes del espaciador, dejando espacio en tél otro lado para gel para ser vertido y un estándar de proteína o escalera para ser cargado.
   5. Si el borde inferior de la tira de gel contiene ningún zonas poco uniformes, corte con cuidado a la basura. Si está presente, se atrapar burbujas durante gel vertido.
   6. Una vez que la tira de gel se coloca correctamente, coloque la placa de cubierta sobre la placa espaciadora. Aplique una leve presión para expulsar las burbujas de aire atrapadas.
   7. Continuar para montar el aparato de gel-vertido de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
3. Añadir los reactivos de polimerización para el tampón de gel de resolución, y se vierte en el casete de gel preparado, usando una pipeta serológica. Llenar el casete de gel a ~ 2 cm por debajo de la tira de gel BN-PAGE extirpado, para dejar espacio para el apilamiento de capas.
4. Añadir 100! L butanol sobre la parte superior del gel se vierte, y permitir que 30 min para la polimerización de la capa de la solución. Retirar el butanol.
5. Añadir los reactivos de polimerización para la solución de gel de apilado. El uso de un serologpipeta ical, se vierte la capa de apilamiento para llenar todo el espacio vacío que queda en el casete de gel.
   1. Incline la casete de gel como la capa de apilamiento se vierte de modo que llene el espacio por debajo de la tira de gel, y las burbujas de aire no están atrapados.
   2. A medida que el tampón de gel de apilamiento llena el espacio vacío debajo de la tira de gel, gradualmente devolver el casete de gel a pie de nivel.
   3. Continuar para llenar el espacio vacío al lado de la tira de gel escindido con el tampón de gel de apilamiento, hasta que casi se desborda.
6. Permitir que la capa de apilamiento polimerizar durante 30 min.
   NOTA: Hacer 10x SDS-PAGE tampón de ejecución (tris 250 mM (hidroximetil) aminometano (TRIS), 1,9 M de glicina, 1% SDS), mientras que el gel se polimeriza. Esto también se puede hacer de antemano y se almacena a temperatura ambiente.
7. Diluir 50 ml de 10X tampón de SDS-PAGE corriente Stock en 450 ml dH ₂ O para hacer tampón de trabajo 1x.
8. Después de la capa de apilamiento ha polimerizado, retire la casete de gel de la coladaaparato, enjuague con dH ₂ O, y montar el aparato de electroforesis de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
9. Llenar la cámara interior completamente con tampón de ejecución SDS-PAGE 1x, a continuación, llenar la cámara exterior hasta el nivel indicado por el fabricante.
10. Cargar el espacio al lado de la tira de gel escindido con una escalera de peso molecular o patrón de proteína apropiada.
11. Coloque los electrodos a la fuente de alimentación, y a electroforesis las muestras a 120 V. Cuando el colorante Coomassie se sale de la gel, parar y desconectar la fuente de alimentación.
12. Analizar el gel usando métodos estándar de electrotransferencia y detección de proteínas mediante la unión ¹⁰ de anticuerpo.

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Resultados

En este experimento de demostración, multímero-PAGE se realizó en toda lisado de cerebro de rata. Las proteínas resultantes separados se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF), y después se sondaron con anticuerpos contra las proteínas que se sabe que forman complejos. La figura 1 muestra una validación del protocolo por dos medios. En primer lugar, se demuestra que las proteínas reticuladas son escindibles mediante la adición de un age...

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Discusión

interacciones proteína-proteína son importantes para cada tarea de los seres vivos llevan a cabo. Debido a esto, son objeto de un intenso escrutinio y la investigación. Multímero-página es un nuevo método para capturar, separar, y el análisis de una amplia gama de complejos de proteínas. Hemos demostrado anteriormente su aplicabilidad al estudio de oligimerization de la proteína α-sinucleína asociada a la enfermedad ^11. Sin embargo, es extensible a muchos complejos de proteínas, como ...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
ε-Aminocaproic acid	Sigma	A2504
Acrylamide	Acros Organics	164855000	Toxic.
Acrylamide/bisacrilamide 37.5:1 (40%T stock solution)	BioRad	161-0148	Toxic.
Ammonium persulfate	Sigma	A3678
Anti rabbit IgG-HRP from goat	Santa Cruz Biotechnology	sc-2004
Bicinchoninic acid assay kit	Thermofisher	23225
Bis-tris	Sigma	B9754
Bovine serum albumin	Sigma	A9647
Butanol	Fisher Scientific	A399-1
Chemiluminescence substrate kit	ThermoFisher	24078
Coomassie blue G-250	Sigma-Aldrich	B0770
Digitonin	Sigma	D141	Toxic.
Dimethyl sulfoxide	Fisher Scientific	D128-1
Dithiobis(succinimidylpropionate)	Thermo Scientific	22585
Dry nonfat milk	LabScientific	M0841
Glycerol	Sigma	G9012
Glycine	Fisher Scientific	BP381-5
Halt Protease Inhibitor Cocktail	Thermofisher	78430
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A144SI-212	For titration. Caustic.
Methanol	Fisher Scientific	A412-4	For PVDF membrane activation. Toxic.
Monoclonal anti α-synuclein IgG from rabbit	Santa Cruz Biotechnology	sc-7011-R
N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine	Sigma	T9281
N,N'-methylenebisacrylamide	Acros Organics	16479	Toxic.
NP40	Boston Bioproducts	P-872
Polysorbate 20 (tween-20)	Fisher Scientific	BP337-500
Polyvinylidene fluoride transfer membranes	Thermo Scientific	88518
Ponceau S	Sigma	P3504
Potassium chloride	Fisher Scientific	P217-3
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P9791
Protease inhibitor cocktail	Thermo Scientific	88265
SDS solution (10% w/v)	BioRad	161-0416
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-212
Sodium dodecyl sulfate	Sigma	L37771
Sodium phosphate monobasic	Fisher Scientific	BP329-1
Tricine	Sigma	T0377
Tris base	Fisher Scientific	BP152-500
Tris-HCl (0.5 M buffer, pH 6.8)	BioRad	161-0799
Tris-HCl (1.5 M buffer, pH 8.8)	BioRad	161-0798
Name	Company	Catalog Number	Comments
Instruments
GE Imagequant LAS 4000	GE Healthcare	28-9558-10
ImageJ software	NIH
Synergy H1 microplate reader	BioTek
Gel Former + Stand	Biorad
Microfuge 22R centrifuge	Beckman Coulter
2 mL dounce homogenizer
Vortex mixer	Fisher Scientific
Ultrasonic tissue homogenizer	Fisher Scientific	FB120220