Multimer-PAGE: Un metodo per acquisire e risolvere i complessi proteici nei campioni biologici

Riepilogo

Metodo per la stabilizzazione e la separazione complessi proteici nativi di lisato tessuto non modificato utilizzando una proteina reticolante amminico reattivo accoppiato ad un romanzo elettroforesi bidimensionale poliacrilammide sistema (PAGE) è presentato.

Abstract

Ci sono molti metodi ben sviluppati per purificare e studiare singole proteine ​​e peptidi. Tuttavia, la maggior parte delle funzioni cellulari sono svolte da reti di interazione complessi proteici, che sono spesso difficili da studiare perché il loro legame non covalente e facilmente perturbato da tecniche di purificazione. Questo lavoro descrive un metodo per stabilizzare e separare complessi proteici nativi da tessuto non modificato usando elettroforesi bidimensionale poliacrilammide. Tessuto lisato viene caricato su un gel di poliacrilammide-blu nativa non denaturante, quindi una corrente elettrica viene applicata fino a quando la proteina migra a breve distanza nel gel. La striscia gel contenente la proteina migrato viene poi asportato e incubato con le ditiobis ammina reattiva reticolanti reagenti (succinimidil propionato), che stabilizza covalentemente complessi proteici. La striscia gel contenente complessi reticolati viene poi gettato in un gel di poliacrilammide sodio dodecil solfato, e tegli complessi sono separati completamente. Il metodo si basa su tecniche e materiali noti alla maggior parte dei biologi molecolari, che significa che è poco costoso e facile da imparare. Mentre è limitato nella sua capacità di separare adeguatamente estremamente grandi complessi, e non è stato universalmente successo, il metodo è stato in grado di catturare una vasta gamma di complessi ben studiato, ed è probabile applicabile a molti sistemi di interesse.

Introduzione

Funzione cellulare normale dipende da interazioni proteina-proteina ^{1, 2.} Come risultato, malattie umane sono spesso caratterizzate da perturbazioni nel montaggio e il comportamento di vari complessi proteici ^3. La capacità di caratterizzare tali interazioni è quindi cruciale. attuali mezzi di rilevamento di queste interazioni richiedono purificazione di proteine ​​target, spesso seguite da discesa dei loro partner interagenti. Purificazione convenzionale viene realizzata mediante centrifugazione differenziale, precipitazione e / o cromatografia ^4. Questi metodi richiedono tempo, devono essere modificati per ogni proteina bersaglio, e spesso sfociano in basse rese. I moderni metodi di purificazione comporta la fusione di tag peptidici di proteine bersaglio, seguita da immunoprecipitazione o estrazione su colonne carichi di perline legati ad una molecola di cattura ^5,"> 6. Mentre questo è estensibile per molte proteine, richiede sequenza modificazione del bersaglio, causando un potenziale costrutti che differiscono affinità per loro soliti partner di legame. La delicatezza di alcune interazioni proteina-proteina significa che questo metodo non può essere applicabile per molti scenari. Inoltre, i saggi di pull-down utilizzati per mappare le interazioni proteina-proteina possono non catturare un quadro preciso cellulari, a causa di gradi di libertà e limitato i livelli di non-native della proteina esca.

Idealmente, complessi proteici possono essere rilevati nei loro stati native, senza la necessità di depurazione o di pull-down. Blu nativo elettroforesi su gel di poliacrilammide (BN-PAGE) è stato sviluppato come meno denaturante alternativa sodio dodecil solfato elettroforesi su gel di poliacrilammide (SDS-PAGE), e consente la separazione di alcune proteine e complessi da campioni biologici ^7. Tuttavia, le proteine ​​in BN-PAGE separate basate su una larnumero ge di variabili, tra cui le dimensioni, carica, struttura tridimensionale, e associazione con altre molecole. Le interazioni di questi fattori causano spesso co-separazione delle proteine, formazione di aggregati, e scarsa risoluzione banda proteica. Elettroforesi bidimensionale nativo-poliacrilammide risolve alcuni, ma non tutti, questi problemi ^8.

Per aggirare le complicazioni associate con separazione nativo, alcuni autori utilizzano reagenti ammina reattiva reticolanti, come ditiobis (propionato succinimmidil) (DSP), per catturare complessi proteici in lisati di tessuto ^4. Questi lisati trattati possono essere denaturate e separate mediante SDS-PAGE, preservando la dimensione originale e il trucco complessi proteici. Tuttavia, poiché i reagenti reticolazione reagiscono in base alla vicinanza di una molecola a un'altra, e le proteine ​​nei lisati tissutali avere molti gradi di libertà e può stocasticamente interagire fondo non specifica croceIl legame può essere elevato, soprattutto nei campioni concentrati. Ciò può portare a risultati difficili da interpretare.

Qui dimostriamo l'utilizzo di un metodo ibrido BN-PAGE / SDS-PAGE, denominato elettroforesi multimer-poliacrilammide (multimer-PAGE), per separare e rilevare gruppi di proteine ​​in miscele complesse. Inizialmente, il lisato cellulare viene sospeso in gel di poliacrilamide tramite BN-PAGE. Il gel contenente lisato viene quindi reagito con il reagente di reticolazione DSP. Pseudo-immobilizzato e leggermente separato sul gel, le proteine ​​sono molto meno probabilità di reagire in modo non specifico, il che significa che la reattività di cross-linker di sfondo è ridotta. Dopo la reticolazione, le bande di gel vengono escise e separate mediante SDS-PAGE. Il gel risultante può quindi essere analizzato con qualsiasi mezzo tipicamente associato all'elettroforesi del gel di poliacrilammide. Questo metodo consente la separazione e la rilevazione di complessi proteici nativi in ​​lisato tissutale non modificato, senza la necessità di ulteriori purificazione o tiraturan.

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Protocollo

1. Preparazione del tessuto

1. Preparare 10 ml di 4x tampone campione BN-PAGE (200 mM Bis (2-idrossietil) ammino-tris (idrossimetil) metano (Bis-Tris), 200 mM NaCl, 40% w / v di glicerolo, 0,004% Ponceau S, pH 7,2 ).
   NOTA: Questa soluzione madre può essere effettuato in anticipo e conservato a 4 ° C.
2. Diluire 250 ml di tampone campione 4x in 750 microlitri dH ₂ O contenente 1x commerciale cocktail di inibitori delle proteasi. Vortex e freddo sul ghiaccio.
3. Omogeneizzare 20 mg di tessuto bersaglio nel tampone campione BN-PAGE 1 mL 1x ghiacciata con 30 colpi di un omogeneizzatore Dounce pulito.
   Nota: per questo esperimento di dimostrazione, il tessuto bersaglio è tutto il tessuto del cervello di ratto. Dopo omogeneizzazione, i campioni possono essere trattati con detergente delicato come 2% digitonina di solubilizzare e permettere elettroforesi delle proteine ​​di membrana.
4. Trasferire l'omogeneizzato in una provetta da microcentrifuga da 1,5, e centrifugare a 14000 xg per 30 min a pellet contenuto cellulare insolubili. afteR centrifugazione, decantare il surnatante in una provetta pulita sul ghiaccio.
5. Seguire le istruzioni del produttore per misurare la concentrazione di proteine ​​surnatante utilizzando acido bicinconinico (BCA) o simile saggio delle proteine ​​quantificazione.
6. Se il campione omogenato (s) contengono detersivo, aggiungere una quantità di 5% Coomassie Blu G-250 in soluzione acquosa sufficiente a portare la soluzione omogenato al 0,25% Coomassie.

2. BN-PAGE

1. Diluire 25 mL 20x nativo blu (BN) elettroforesi scorta (1,0 M Bis-Tris, 1.0 M tricina, pH 6,8) in 475 ml di dH ₂ O contenente 0,002% Coomassie Blu per ottenere 500 ml di 1x tampone di corsa.
   1. Se i campioni contengono detersivo, anziché fare 250 mL di tampone di corsa 1x contenente 0,02% di Coomassie e altri 250 mL contenenti nessuno.
2. tampone freddo (s) a 4 ° C.
3. Pulire e assemblare un gel di poliacrilammide versando cassetta secondo le istruzioni del produttore.
4. Pour BN gel di poliacrilammide (3% strato T impilabili, 6% T risolvere strato) secondo una ricetta standard ^7, e posizionare il pettine pozzo.
5. Dopo i gel sono polimerizzati, sciacquare la cassetta con dH ₂ O e montare l'apparecchiatura elettroforesi secondo le istruzioni del produttore.
6. Rimuovere il pettine bene e riempire i pozzetti con 1x tampone di corsa BN-PAGE. Evitare di riempire l'intera camera interna con buffer finché i campioni vengono caricati.
   1. Se i campioni contengono detersivo, riempire i pozzetti con il tampone contenente 0,02% Coomassie Blu.
      NOTA: Eseguire le operazioni da 2,7-2,9 a 4 ° C.
7. Utilizzando punte gel-caricamento, pipetta un volume di omogenato contenente 20 ug di proteine ​​nei pozzetti desiderati. Pipettare un volume equivalente di 1x tampone campione BN-PAGE in nessuna pozzetti inutilizzati.
   NOTA: Utilizzare la concentrazione di proteine ​​determinata dal saggio BCA per calcolare il volume appropriato di omogeneizzato da aggiungere allai pozzi.
8. Dopo che i campioni sono caricati, riempire la camera interna con 1x tampone BN-PAGE esecuzione. Assicurarsi che il gel è interamente immerso in un tampone. Successivamente, riempire la camera esterna con 1x tampone esecuzione al livello indicato dal costruttore.
   1. Se i campioni contengono detersivo, riempire la camera interna con il tampone 1x contenente 0,02% di Coomassie Blu, e la camera esterna con 1x esente da colorante tampone di corsa.
9. Collegare gli elettrodi per l'alimentazione, e elettroforesi le proteine ​​nel gel a 150 V finché la banda colorante progredisce ~ 2 centimetri in risolvere strato. Stop e scollegare l'alimentazione.

3. Cross-linking

NOTA: Eseguire i passaggi 3,1-3,6 a 4 ° C.

1. Smontare l'apparecchio di elettroforesi, e separare i vetri della cassetta gel. Rimuovere ed eliminare lo strato di sovrapposizione.
2. Accuratamente tagliare il gel appena sotto il bordo inferiore del fronte del colorante. PrendereCura di rendere questo taglio il più possibile liscio e diretto e quindi scartare il pezzo inutilizzato di gel. Questo lascerà una striscia di gel di poliacrilamide largo ~ 2 cm, che contiene tutte le proteine ​​del campione omogeneo.
3. Tagliare le parti inutilizzate lungo i bordi della striscia di gel.
4. Collocare con cura la striscia in 10 ml di soluzione salina fosfata tamponata (PBS) in un piccolo contenitore e mescolare delicatamente con la nutrimento per 30 minuti per equilibrare.
5. Dopo aver equilibrato, scartare e sostituire il PBS con altri 10 mL. Pipettare 500 μl di 25 mM DSP sciolto in dimetilsolfossido nel PBS e continuare a miscelare come sopra (fase 3.4) per 30 min.
6. Versare la soluzione DSP. Aggiungere 10 mL di cloruro di tris (idrossimetil) aminometano (Tris-HCl) di 0,375 M, pH 8,8, contenente 2% di sodio dodecil solfato (SDS) per staccare il DSP non reagito. Continuare la nutrazione per 15 minuti.

4. SDS-PAGE

1. Mentre la striscia di gel sta spegnendo, preparare SDS-PASoluzioni gel GE secondo metodi standard ^9. Non aggiungere i reagenti di polimerizzazione.
2. Dopo lo spegnimento, restituire la striscia gel ΒΝ a temperatura ambiente, e gettato la striscia in una nuova cassetta gel.
   1. Per fare questo, con attenzione raccogliere il gel e posizionarlo su un gel cassette piastra distanziale pulita.
   2. Orientare la striscia in modo che la parte inferiore del fronte del colorante è più vicino all'inizio della nuova cassetta (cioè, il lato che ha viaggiato lontano durante BN-PAGE dovrebbe essere più vicino alla parte superiore della nuova cassetta, il nastro gel deve essere ruotato dalla sua prima orientamento). Vedi Figura 3.
   3. Posizionare la striscia in modo tale che il suo bordo superiore si trova anche con cui il bordo superiore della piastra di copertura sarà (cioè, sarà in cima nuovo gel). Assicurarsi che il fronte del colorante è parallela ai bordi orizzontali della lastra di vetro.
   4. Spingere un lato della striscia asportato contro una delle pareti distanziatori, lasciando spazio su tegli dall'altro per gel da versare e ad una normale proteina o scala da caricare.
   5. Se il bordo inferiore della striscia gel contiene le aree irregolari Di, tagliarli accuratamente via. Se presenti, si intrappola le bolle durante gel colata.
   6. Una volta che la striscia gel è posizionata correttamente, fissare la piastra di copertura sulla piastra distanziale. Applicare una leggera pressione per far uscire eventuali bolle d'aria intrappolate.
   7. Continuare a montare l'apparato gel versare secondo le istruzioni del produttore.
3. Aggiungere i reagenti di polimerizzazione al buffer di gel risolvere, e versarlo nella cassetta di gel preparata, con una pipetta sierologica. Riempire la cassetta gel per ~ 2 cm sotto la striscia di gel BN-PAGE asportato, per lasciare spazio per la sovrapposizione dei livelli.
4. Aggiungere 100 microlitri butanolo sopra la parte superiore del gel versato, e consentire 30 minuti per la polimerizzazione dello strato risolvere. Eliminare il butanolo.
5. Aggiungere reagenti di polimerizzazione alla soluzione di gel di impilamento. Utilizzando un serologpipetta ical, versare lo strato di sovrapposizione ad occupare tutto lo spazio vuoto rimanente nella cassetta gel.
   1. Inclinare la cassetta gel come lo strato di sovrapposizione viene versato in modo da riempire lo spazio sotto la striscia di gel, e le bolle d'aria non sono intrappolati.
   2. Come tampone di gel di impilamento riempie lo spazio vuoto al di sotto della striscia di gel, gradualmente restituire la cassetta gel a livello piede.
   3. Continuare a riempire lo spazio vuoto accanto alla striscia gel asportato con il tampone di gel di impilamento, fino quasi overflow.
6. Lasciare che la sovrapposizione dei livelli di polimerizzare per 30 min.
   NOTA: Fare 10x SDS-PAGE tampone di corsa (250 mM tris (idrossimetil) amminometano (tris), 1,9 M glicina, 1% SDS), mentre il gel è polimerizza. Questo può anche essere fatto in anticipo e conservato a temperatura ambiente.
7. Diluire 50 mL 10X SDS-PAGE tampone esecuzione stock in 450 mL dH ₂ O per rendere tampone di lavoro 1x.
8. Dopo che lo strato di sovrapposizione è polimerizzato, rimuovere la cassetta gel dalla colataApparecchiatura, lavare con dH ₂ O, e montare l'apparecchiatura elettroforesi secondo le istruzioni del produttore.
9. Riempire la camera interna completamente con tampone di corsa SDS-PAGE 1x, quindi riempire la camera esterna al livello indicato dal costruttore.
10. Caricare spazio accanto alla striscia gel escisse con una scala peso molecolare o standard proteina appropriata.
11. Collegare gli elettrodi per l'alimentazione, e elettroforesi i campioni a 120 V. Quando il colorante Coomassie corre il gel, arrestare e scollegare l'alimentazione.
12. Analizzare il gel usando metodi standard di elettroblotting e rilevazione proteica legandosi ¹⁰ anticorpo.

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Risultati

In questo esperimento di dimostrazione, multimero-PAGE è stata eseguita su tutto il lisato cervello di ratto. Le proteine ​​risultanti separati sono stati trasferiti su di polivinilidene (PVDF) diflouride membrane, e poi incubate con anticorpi contro le proteine ​​che sono noti per formare complessi. La figura 1 mostra una convalida del protocollo in due modi. In primo luogo, abbiamo dimostrato che le proteine reticolate sono scindibile mediante aggiunta di un a...

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Discussione

interazioni proteina-proteina sono importanti per ogni compito esseri viventi svolgono. A causa di questo, sono oggetto di intenso scrutinio e di ricerca. Multimero-PAGE è un nuovo metodo per l'acquisizione, la separazione e l'analisi di un'ampia gamma di complessi proteici. Abbiamo precedentemente dimostrato la sua applicabilità a studiare oligimerization della malattia associata proteina α-sinucleina ^11. Tuttavia, è estendibile a molti complessi proteici, come mostrato nella

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
ε-Aminocaproic acid	Sigma	A2504
Acrylamide	Acros Organics	164855000	Toxic.
Acrylamide/bisacrilamide 37.5:1 (40%T stock solution)	BioRad	161-0148	Toxic.
Ammonium persulfate	Sigma	A3678
Anti rabbit IgG-HRP from goat	Santa Cruz Biotechnology	sc-2004
Bicinchoninic acid assay kit	Thermofisher	23225
Bis-tris	Sigma	B9754
Bovine serum albumin	Sigma	A9647
Butanol	Fisher Scientific	A399-1
Chemiluminescence substrate kit	ThermoFisher	24078
Coomassie blue G-250	Sigma-Aldrich	B0770
Digitonin	Sigma	D141	Toxic.
Dimethyl sulfoxide	Fisher Scientific	D128-1
Dithiobis(succinimidylpropionate)	Thermo Scientific	22585
Dry nonfat milk	LabScientific	M0841
Glycerol	Sigma	G9012
Glycine	Fisher Scientific	BP381-5
Halt Protease Inhibitor Cocktail	Thermofisher	78430
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A144SI-212	For titration. Caustic.
Methanol	Fisher Scientific	A412-4	For PVDF membrane activation. Toxic.
Monoclonal anti α-synuclein IgG from rabbit	Santa Cruz Biotechnology	sc-7011-R
N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine	Sigma	T9281
N,N'-methylenebisacrylamide	Acros Organics	16479	Toxic.
NP40	Boston Bioproducts	P-872
Polysorbate 20 (tween-20)	Fisher Scientific	BP337-500
Polyvinylidene fluoride transfer membranes	Thermo Scientific	88518
Ponceau S	Sigma	P3504
Potassium chloride	Fisher Scientific	P217-3
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P9791
Protease inhibitor cocktail	Thermo Scientific	88265
SDS solution (10% w/v)	BioRad	161-0416
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-212
Sodium dodecyl sulfate	Sigma	L37771
Sodium phosphate monobasic	Fisher Scientific	BP329-1
Tricine	Sigma	T0377
Tris base	Fisher Scientific	BP152-500
Tris-HCl (0.5 M buffer, pH 6.8)	BioRad	161-0799
Tris-HCl (1.5 M buffer, pH 8.8)	BioRad	161-0798
Name	Company	Catalog Number	Comments
Instruments
GE Imagequant LAS 4000	GE Healthcare	28-9558-10
ImageJ software	NIH
Synergy H1 microplate reader	BioTek
Gel Former + Stand	Biorad
Microfuge 22R centrifuge	Beckman Coulter
2 mL dounce homogenizer
Vortex mixer	Fisher Scientific
Ultrasonic tissue homogenizer	Fisher Scientific	FB120220