Multimer-PAGE: Biyolojik örnekler olarak yakalamak için bir yöntem ve özümleme protein kompleksleri

Özet

stabilize edici ve yeni bir iki boyutlu poliakrilamit jel elektroforez bağlanmış bir amin-reaktif protein çapraz bağlayıcı kullanılarak modifiye edilmemiş doku lizattan doğal protein kompleksleri ayırmak için bir yöntem olup (PAGE) sistemi sunulmuştur.

Özet

arındırıcı ve tek proteinler ve peptidler çalışmak için pek iyi gelişmiş yöntemler vardır. Bununla birlikte, en çok hücresel işlev, sıklıkla, kovalent olmayan ve kolay bir saflaştırma teknikleri ile bozulmuş olan bir bağlanma araştırılması için zor olan etkileşimli protein komplekslerinin ağlar tarafından gerçekleştirilmektedir. Bu çalışma, stabilize edici ve iki boyutlu poliakrilamit jel elektroforez ile modifiye edilmemiş dokusundan doğal protein kompleksleri ayırmak için bir yöntem tarif eder. Doku lisatı, protein jel içine kısa bir mesafede yer değiştirmektedir kadar sonra bir elektrik akımı uygulandığında, bir denatüre edici olmayan mavi doğal poliakrilamid jel üzerine yüklenir. Taşınan protein ihtiva eden jel şeridi daha sonra kesilmiş ve kovalent protein kompleksleri stabilize amin reaktif çapraz bağlama reaktifi ditiobis (sukinimidil propionat) ile inkübe edilir. çapraz bağlı kompleksler ihtiva eden jel şeridi daha sonra bir sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel içine dökülür, ve t,O kompleksleri tamamen ayrılır. yöntem ucuz ve öğrenmesi kolay, yani teknikleri ve en moleküler biyologlar için tanıdık malzemelere dayanır. yeterince aşırı büyük kompleksleri ayırmak için yeteneği sınırlıdır ve evrensel başarılı olmamıştır da, yöntem iyi çalışılmış komplekslerinin çeşitli yakalamak başardı ve ilgi birçok sistemde muhtemelen geçerlidir.

Giriş

Normal hücre fonksiyonlarını protein-protein ^{etkileşimleri, 1, 2} bağlıdır. Bunun bir sonucu olarak, insan hastalıkları genellikle çeşitli protein kompleksleri ³ montajı ve davranış düzensizlik tarafından işaretlenir. Böyle etkileşimleri karakterize yeteneği dolayısıyla çok önemlidir. Bu etkileşimlerin tespit Mevcut araçları genellikle etkileşim ortakları çekme-aşağı ve ardından hedef proteinler, saflaştırılmasını gerektirir. Geleneksel saflaştırma diferansiyel santrifüj, çökeltme ve / veya kromatografi ⁴ ile gerçekleştirilir. Bu yöntemler zaman alıcıdır, her bir hedef protein için değiştirilmesi gerekir, ve genellikle düşük verimlerle sonuçlanabilir. Modern saflaştırma ^yöntemleri, bir yakalama molekülü ⁵ bağlanmış boncuklarıyla yüklenmiş sütunlar üzerinde bağışıklık çökeltmesi ya da ekstre proteinleri hedef peptid etiketleri kaynaşmasını içerenBu, bir çok proteinin şekilde uzatılabilir da "> 6., Potansiyel olarak her zamanki bağlanma partnerleri için afinite açısından farklılık yapılarda ortaya çıkan hedef sekansı, bir modifikasyonunu gerektirir. Bazı protein-protein etkileşimleri, hassas doğası, bu yöntem uygulanabilir olmayabilir demektir birçok senaryolara. Ayrıca, protein-protein etkileşimleri eşleştirmek için kullanılan açılan tahliller nedeniyle özgürlük ve yem proteinin yerli olmayan seviyelerinin kısıtlı derecelerde, doğru bir hücresel resim toplayamaz.

İdeal olarak, protein kompleksleri saflaştırma veya çekme aşağı gerek kalmadan, doğal hallerine tespit edilebilir. Mavi doğal poliakrilamid jel elektroforezi (BN-PAGE), sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) için daha az denatüre alternatif olarak geliştirilen ve biyolojik örnekler ⁷ bazı proteinler ve komplekslerin ayrılması için izin veriliyordu. Bununla birlikte, BN-PAGE'de proteinler lar göre ayırmakdiğer moleküllerle boyut, yük ve üç boyutlu yapı ve birlikte dahil olmak üzere değişkenlerin ge sayısı. Bu faktörlerin etkileşimler genellikle proteinlerin eş ayrılması, agregat oluşumu ve kötü protein bandı çözünürlüğü ile sonuçlanır. İki boyutlu yerli-poliakrilamid jel elektroforezi bu sorunların ^8, hepsi bir giderir, ama.

Doğal ayrılması ile ortaya çıkan komplikasyonları aşmak için, bazı yazarlar, doku lysate'lerin ⁴ protein kompleksleri yakalamak için bu ditiyobis (süksinimidil propionat) gibi amin-reaktif çapraz bağlama reaktifleri, (DSP) kullanır. Bu muamele edilmiş Lizatlar daha sonra denatüre edilmiş ve protein kompleksleri doğal boyutu ve makyaj korurken, SDS-PAGE ile ayrılabilir. çapraz bağlama reaktifleri, doku lizatlarında başka bir molekülün yakınlığı ve proteinlere dayalı tepki Bununla birlikte, çok serbestlik derecelerine sahip ve stokastik, spesifik olmayan arka plan çapraz etkileşim-linking özellikle konsantre örneklerinde, yüksek olabilir. Bu zor-yorumlama sonuçlara yol açabilir.

Burada, bir hibrid BN-PAGE / SDS-PAGE yöntemiyle kullanımını gösteren, ayrı ve kompleks karışımlar protein derlemeleri tespit etmek için, multimeri-poliakrilamid jel elektroforezi (multimer-PAGE) olarak adlandırılır. Başlangıçta, hücre lizatı, BN-PAGE ile poliakrilamid jel içinde süspansiyon haline getirilir. lizat içeren Jel daha sonra çapraz bağlama reaktifi DSP ile reaksiyona sokulur. Sözde hareketsiz ve biraz jeli üzerinde ayrıldı, proteinler arka çapraz bağlayıcı tepkime azalır, yani daha az spesifik olmayan bir tepki muhtemeldir. Çapraz bağlanma sonrası, jel, bantlar kesilir ve SDS-PAGE ile ayrılmıştır. Elde edilen jel daha sonra, tipik olarak poliakrilamid jel elektroforezi ile ilişkili herhangi bir yolla analiz edilebilir. Bu yöntem, ilave saflaştırma veya çekme Dow gerek kalmadan, modifiye edilmemiş doku lizatındaki doğal protein komplekslerinin ayrıştırılması ve algılanması amacıyla sağlarn.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Doku Hazırlanması

1. 4x BN-PAGE numune tampon maddesi (200 mM Bis (2-hidroksietil) amino-tris (hidroksimetil) metan (Bis-Tris), 200 mM NaCI,% 40 a / h gliserol,% 0.004 Ponceau S, pH 7.2, 10 mL hazırlanması ).
   NOT: Bu stok solüsyon önceden yapılmış ve 4 ° C'de saklanabilir.
2. 1x ticari proteaz inhibitörü kokteyli içeren 750 uL dH ₂ O 4x numune tamponu 250 uL seyreltin. Girdap ve buz üzerinde soğuk.
3. Temiz bir Dounce homojenleştirici 30 vuruş 1 mL 1x buz soğukluğunda BN-PAGE numune tampon maddesi içinde, hedef doku, 20 mg homojenize edilir.
   NOT: Bu gösteri deneme için, hedef doku bütün sıçan beyni dokudur. Homojenleştirmeden sonra, numuneler çözünür ve zar proteinlerinin elektroforezi izin vermek üzere hafif bir deterjan gibi% 2 digitonin ile muamele edilebilir.
4. 30 dakika çözünmeyen hücre içeriği: pelet 14,000 x g'de bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne Homojenat, ve santrifüj aktarın. AfteR santrifüj, buz üzerinde temiz bir tüp içine süpernatant süzün.
5. bisinkoninik asit (BCA) ya da benzer protein kantitatif analizi kullanılarak Üst faz, protein konsantrasyonunu ölçmek için üretici talimatları takip edin.
6. Homojenat örnek (ler) deterjan ihtiva ise,% 0.25 Coomassie için homojenat çözüm getirmek için yeterli bir sulu çözelti içinde% 5, Coomassie Mavi G-250, bir miktar ilave edin.

2. BN-PAGE

1. 25 ml 20x mavi yerli seyreltin (BN) içine tampon stok (1.0 M Bis-Tris, 1.0 M Trişin, pH 6.8) elektroforez 475 ml dH 1x çalışan tampon 500 mL olmak üzere% 0.002 Coomassie Blue ihtiva eden ₂ O.
   1. Numuneler deterjan ihtiva bunun yerine% 0.02 Coomassie içeren 1x çalışan tampon 250 mL ve hiçbiri içeren başka bir 250 mL olun.
2. 4 ° C'ye soğutma tamponu (ler).
3. Temizleyin ve üretici talimatlarına göre kaset dökme bir poliakrilamid jel toplayın.
4. Bir standart tarif ^7'ye göre BN poliakrilamid jeli (% 3, T istifleme katman,% 6, T çözme tabakası) dökün ve iyi tarak.
5. Jeller polimerize sonra, DH ₂ O ile kaseti yıkayın ve üretici talimatlarına göre elektroforez aygıtı monte edin.
6. Kuyucuklu bir tarak çıkarın ve 1x BN-PAGE çalışma tamponu ile kuyu doldurun. Numuneler yüklenene kadar tampon ile bütün iç odasının doldurulması kaçının.
   1. Numuneler deterjan ihtiva ise,% 0.02 Coomassie Blue içeren tampon ile kuyu doldurun.
      NOT: 4 ° C'de adımları 2.7-2.9 gerçekleştirin.
7. Jel yükleme ipuçları kullanarak, arzu edilen kuyulara proteinin 20 ug içeren homojenat bir hacim pipetle. kullanılmayan herhangi bir kuyulara 1x BN-PAGE numune tampon maddesi eşdeğer bir hacmi Pipet.
   Not: eklemek için homojenat uygun hacmi hesaplamak için bir BCA aracıyla tespit protein konsantrasyonunu kullanmakuyu.
8. Örnekler yüklendikten sonra, 1 x BN-PAGE çalışma tamponu ile iç bölmeyi doldurmak. Jel tamamen tampon altında olduğundan emin olun. Daha sonra, üretici tarafından belirtilen seviyeye 1x çalışma tamponu ile dış oda doldurun.
   1. Numuneler deterjan ihtiva ise,% 0.02 Coomassie mavisi içeren 1 x tampon ve boya içermeyen 1x çalışan tamponu ile dış hücre iç bölmeyi doldurmak.
9. güç kaynağına Elektrotlar ve boya bant katmanı çözme içine ~ 2 cm ilerler kadar 150 V'de jelde proteinleri Electrophorese. Dur ve güç kaynağını kesin.

3. Çapraz bağlanma

NOT: 4 ° C'de Adımları 3.1-3.6'da gerçekleştirin.

1. elektroforez aygıtı sökün ve jel kasetinin cam levhaların ayrılması. Çıkarın ve yığma tabakasını atın.
2. Dikkatle boya ön alt kenarının altında jel kesti. almakBu kesim olarak yumuşak ve düz bir şekilde mümkün kılmak için bakım ve daha sonra jel kullanılmamış parça atılır. Bu homojenat, numunedeki tüm protein içerecektir geniş bir ~ 2 cm, poliakrilamid jel yatay şerit bırakacaktır.
3. Jel şeridin kenarları boyunca kullanılmamış herhangi bir kısmı Trim.
4. Dikkatli bir şekilde küçük bir kap içinde 10 ml fosfat tamponlu salin (PBS) içine şerit yerleştirin, yavaşça dengelenmeye 30 dakika nutation karıştırın.
5. Dengelemeden sonra, atmak ve başka bir 10 mL PBS ile değiştirin. Pipet 500 uL 25 mM DSP PBS içine dimetil sülfoksit içerisinde çözündürüldü ve 30 dakika boyunca, yukarıdaki (aşama 3.4) karıştırın.
6. DSP çözümü kapalı dökün. Reaksiyona girmemiş DSP gidermek için% 2 sodyum dodesil sülfat (SDS) içeren 0.375 M tris (hidroksimetil) aminometan hidroklorür (tris-HCl), pH 8.8, 10 ml ekleyin. 15 dakika üğrüm devam edin.

4. SDS-PAGE

1. Jel şerit söndürme iken, SDS-PA hazırlanmasıStandart yöntemler ^9'a göre GE jel çözeltileri. Polimerizasyon reaktif eklemeyin.
2. Söndürüldükten sonra, oda sıcaklığına kadar ΒΝ jel şeridi dönmek ve yeni bir jel kasetine şerit dökme.
   1. Bunu yapmak için, dikkatle jel alıp temiz bir jel kaset boşluk tabağa yerleştirin.
   2. Orient boya ön alt yani BN-PAGE sırasında en uzak tarafında yeni bir kaset üstüne yakın gereken yeni kasetinin üst (en yakın olan ve şerit, jel şeridi, önceden gelen çevrilmiş olmalıdır oryantasyon). Şekil 3'e bakınız.
   3. Üst kenarı da kapak plakasının üst kenarı olacak burada ile yer alacağı şekilde şerit yerleştirin (yani, yeni bir jel üstünde olacaktır). boya ön cam levha yatay kenarlarına paralel olduğundan emin olun.
   4. t yer bırakarak ara duvarların birine karşı kesilmiş şeridin bir yan itinjel o diğer tarafı dökülecek ve bir protein standardı veya merdiven yüklenmesine olanak sağlamaktadır.
   5. Jel bandın alt kenarı bir tırtıklı veya alanlar varsa, dikkatli bir şekilde kesilmiş. Eğer mevcut ise, bunlar jel sırasında tuzak kabarcıklar dökme olacaktır.
   6. Jel şerit doğru bir biçimde pozisyonlandığı zaman, ara plaka üzerinde kapak plakası yerleştirin. sıkışan hava kabarcıklarını dışarı itmek için hafif bir baskı uygulayın.
   7. Üretici talimatlarına göre jel-dökme aygıtı monte devam edin.
3. çözündürücü jel tamponuna polimerizasyon reaktifleri ekleyin ve serolojik bir pipet kullanarak hazırlanan jel kaset içine dökün. istif tabakası için oda bırakmak için, kesilmiş BN-PAGE jel şeridin altında yaklaşık 2 cm jel kaseti doldurun.
4. döküldü jel üst üzerinde 100 uL butanol ekleyin ve çözme tabakasının polimerizasyonu için 30 dakika izin verir. butonalün kapalı dökün.
5. Istifleme jeli çözeltisine polimerizasyon reaktifleri ekleyin. Bir serolog kullanmaik pipet, jel kasetinde kalan boş alanı doldurmak için istifleme tabaka dökülür.
   1. bu jel bir şeridin altında alanı doldurur ve hava kabarcıklarının değildir bu nedenle yığın tabaka dökülür gibi jel kaseti yatırın.
   2. istifleme jeli tamponu jel şeridin altında boş alanı doldurur, giderek düzeyde bir taban üzerine jel kaseti döndürür.
   3. yaklaşık taşmaları o kadar bir sonraki istifleme jeli tamponu ile kesilmiş jel şerit boş alanı doldurmak için devam edin.
6. istifleme tabaka 30 dakika boyunca polimerize olmaya bırakın.
   Not: jel polimerize ise 10 x SDS-PAGE çalışma tamponu (250 mM tris (hidroksimetil) aminometan (tris), 1.9 M glisin,% 1 SDS) konur. Bu aynı zamanda önceden yapılmış ve oda sıcaklığında saklanabilir.
7. 1x çalışma tamponu yapmak için 450 ml dH ₂ O içine 50 ml 10X SDS-PAGE çalışma tamponu stokunu.
8. istifleme tabaka polimerize sonra, dökme elde edilen jel kaseti çıkarmakcihaz, dH ₂ O ile durulayın ve üretici talimatlarına göre elektroforez aygıtı monte edin.
9. Bundan sonra, imalatçı tarafından belirtilen seviyeye dış bölmeyi doldurmak, 1 x SDS-PAGE çalışma tamponu ile tamamen iç bölme doldurun.
10. Bir sonraki bir molekül ağırlığı merdiven ya da uygun protein standardı ile kesilmiş jel şeride yer yükleyin.
11. güç kaynağına elektrotları takın ve Coomassie boyası jel kapalı çalışır zaman 120 V'ta örnekleri Electrophorese, dur ve güç kaynağı ayırın.
12. ¹⁰ bağlayıcı antikor tarafından elektrobeneklenme ile ve protein saptaması standart yöntemler kullanılarak jel analiz edin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bu gösteri deneyinde, multimeir-PAGE bütün sıçan beyni lizatının gerçekleştirildi. Elde edilen ayrılan proteinler poliviniliden diflouride (PVDF) membran üzerinde lekelenir ve sonra kompleksler oluşturmak üzere bilinen proteinlere karşı antikorlar ile problanmıştır. Şekil 1, iki ile protokolünün bir doğrulama gösterir. İlk olarak, çapraz bağlanmış proteinler, çapraz bağlama reaktifi ile oluşturulmaktadır gözlenen daha yüksek molekül ağ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Protein-protein etkileşimleri canlılar yürütmek her görev için önemlidir. Bu nedenle, bunlar yoğun inceleme ve araştırma konusudur. Multimer-PAGE yakalama ayrılması ve protein kompleksleri çok çeşitli analiz etmek için bir yeni yöntemdir. Daha önce hastalıkla bağlantılı protein α-sinüklein ¹¹ oligimerization okuyan uygulanabilirliğini ortaya koymuştur. Şekil 2'de gösterildiği gibi Bununla birlikte, pek çok protein kompleksleri için uzatılabilir...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
ε-Aminocaproic acid	Sigma	A2504
Acrylamide	Acros Organics	164855000	Toxic.
Acrylamide/bisacrilamide 37.5:1 (40%T stock solution)	BioRad	161-0148	Toxic.
Ammonium persulfate	Sigma	A3678
Anti rabbit IgG-HRP from goat	Santa Cruz Biotechnology	sc-2004
Bicinchoninic acid assay kit	Thermofisher	23225
Bis-tris	Sigma	B9754
Bovine serum albumin	Sigma	A9647
Butanol	Fisher Scientific	A399-1
Chemiluminescence substrate kit	ThermoFisher	24078
Coomassie blue G-250	Sigma-Aldrich	B0770
Digitonin	Sigma	D141	Toxic.
Dimethyl sulfoxide	Fisher Scientific	D128-1
Dithiobis(succinimidylpropionate)	Thermo Scientific	22585
Dry nonfat milk	LabScientific	M0841
Glycerol	Sigma	G9012
Glycine	Fisher Scientific	BP381-5
Halt Protease Inhibitor Cocktail	Thermofisher	78430
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A144SI-212	For titration. Caustic.
Methanol	Fisher Scientific	A412-4	For PVDF membrane activation. Toxic.
Monoclonal anti α-synuclein IgG from rabbit	Santa Cruz Biotechnology	sc-7011-R
N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine	Sigma	T9281
N,N'-methylenebisacrylamide	Acros Organics	16479	Toxic.
NP40	Boston Bioproducts	P-872
Polysorbate 20 (tween-20)	Fisher Scientific	BP337-500
Polyvinylidene fluoride transfer membranes	Thermo Scientific	88518
Ponceau S	Sigma	P3504
Potassium chloride	Fisher Scientific	P217-3
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P9791
Protease inhibitor cocktail	Thermo Scientific	88265
SDS solution (10% w/v)	BioRad	161-0416
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-212
Sodium dodecyl sulfate	Sigma	L37771
Sodium phosphate monobasic	Fisher Scientific	BP329-1
Tricine	Sigma	T0377
Tris base	Fisher Scientific	BP152-500
Tris-HCl (0.5 M buffer, pH 6.8)	BioRad	161-0799
Tris-HCl (1.5 M buffer, pH 8.8)	BioRad	161-0798
Name	Company	Catalog Number	Comments
Instruments
GE Imagequant LAS 4000	GE Healthcare	28-9558-10
ImageJ software	NIH
Synergy H1 microplate reader	BioTek
Gel Former + Stand	Biorad
Microfuge 22R centrifuge	Beckman Coulter
2 mL dounce homogenizer
Vortex mixer	Fisher Scientific
Ultrasonic tissue homogenizer	Fisher Scientific	FB120220