Multímero-PAGE: Um método para capturar e Solução de proteína em amostras biológicas Complexos

Resumo

Um método para estabilizar e separando complexos de proteína nativa a partir de lisado de tecido não modificado utilizando uma proteína de reticulação reactivo com amina ligado a uma electroforese em gel de poliacrilamida bidimensional novo sistema (PAGE) é apresentada.

Resumo

Existem muitos métodos bem desenvolvidos para purificar e estudar proteínas individuais e peptídeos. No entanto, a maioria das funções celulares são realizados por redes de complexos de proteínas que interagem, que são muitas vezes difíceis de investigar, porque a sua ligação é não-covalente e facilmente perturbado por técnicas de purificação. Este trabalho descreve um método de estabilização e separando complexos de proteína nativa a partir de tecido não modificado utilizando electroforese em gel de poliacrilamida bidimensional. lisado de tecido é carregado num gel de poliacrilamida nativo azul-n desnaturante, em seguida, uma corrente eléctrica é aplicada até que a proteína migra uma curta distância dentro do gel. A tira de gel contendo a proteína migrado é então excisada e incubadas com as ditiobis reactivos de amina reagente de ligação cruzada (propionato de succinimidilo), que estabiliza covalentemente complexos de proteínas. A tira de gel contendo complexos de ligação cruzada é então moldada num gel de poliacrilamida de sulfato de dodecilo de sódio, e tele complexos são separados completamente. O método baseia-se em técnicas e materiais familiares para a maioria dos biólogos moleculares, o que significa que é barato e fácil de aprender. Enquanto que é limitada na sua capacidade para separar adequadamente extremamente grandes complexos, e não tem sido universalmente bem sucedida, o método foi capaz de capturar uma grande variedade de complexos bem estudadas, e é provavelmente aplicável a muitos sistemas de interesse.

Introdução

Função celular normal é dependente de interacções proteína-proteína de ^{1, 2.} Como resultado, as doenças humanas são frequentemente caracterizadas por perturbações na montagem e comportamento de vários complexos de proteínas ^3. A capacidade de caracterizar essas interacções é, por conseguinte, crítica. meios actuais de detecção destas interacções requerem purificação de proteínas alvo, muitas vezes seguidos por suspenso de seus parceiros interactuantes. Clássica de purificação é realizado por centrifugação diferencial, precipitação e / ou cromatograf ia em ^4. Estes métodos são demorados, deve ser alterado para cada proteína alvo, e muitas vezes resultam em baixos rendimentos. Modernos métodos de purificação envolvem a fusão de sinais peptídicos a proteínas alvo, seguido de imunoprecipitação ou de extracção em colunas carregadas com esferas ligadas a uma molula de captura ^5,"> 6. Embora esta seja extensível para muitas proteínas, que exige modificação da sequência do alvo, potencialmente resultando em construções que diferem na afinidade para os seus parceiros de ligação usuais. A natureza delicada de algumas interacções proteína-proteína significa que este método pode não ser aplicável para muitos cenários. Além disso, os ensaios de pull-down utilizadas para mapear as interações proteína-proteína pode não capturar uma imagem celular precisa, devido à graus restritos de liberdade e os níveis de não-nativos da proteína isca.

Idealmente, os complexos de proteína podia ser detectada nos seus estados nativos, sem a necessidade de purificação ou suspenso. Electroforese em gel de poliacrilamida nativa azul (BN-PAGE) foi desenvolvido como uma alternativa menos desnaturante a electroforese em gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE), e permite a separação de algumas proteínas e complexos a partir de amostras biológicas ^7. No entanto, as proteínas em BN-PAGE separadas com base em um large número de variáveis, incluindo tamanho, carga, estrutura tridimensional, e associação com outras moléculas. As interacções destes factores resultam frequentemente em co-separação de proteínas, formação de agregados, e pobre resolução banda de proteína. Electroforese em gel nativo de poliacrilamida bidimensional resolve alguns, mas não todos, estes problemas ^8.

Para contornar as complicações associadas com a separação nativa, alguns autores utilizam reagentes reactivos de amina de reticulao, tais como ditiobis (propionato de succinimidilo) (DSP), para capturar os complexos de proteína em lisados de tecido ^4. Estes lisados ​​tratados pode então ser desnaturado e separadas por SDS-PAGE, preservando ao mesmo tempo o tamanho nativo e a composição de complexos de proteínas. No entanto, uma vez que os reagentes de reticulação reagir com base na proximidade de uma molécula para outra, e proteínas em lisados ​​de tecido tem muitos graus de liberdade e pode interagir estocasticamente, inespecífica transversal fundo-linking pode ser elevado, especialmente em amostras concentradas. Isso pode levar a resultados difíceis de interpretar.

Aqui, demonstramos a utilização de um método híbrido BN-PAGE / SDS-PAGE, denominada electroforese em gel de poliacrilamida-multero (multímero-PAGE), para separar e detectar os conjuntos de proteínas em misturas complexas. Inicialmente, lisado de células é suspenso em gel de poliacrilamida através BN-PAGE. O gel contendo o lisado é então feito reagir com o reagente DSP reticulação. e ligeiramente separadas no gel imobilizada-pseudo, as proteínas são muito menos susceptíveis de reagir de forma não específica, o que significa que a reactividade cruzada de fundo ligante é reduzida. Após a reticulação, as bandas de gel são excisadas e separados por meio de SDS-PAGE. O gel resultante pode então ser analisada por quaisquer meios tipicamente associados com electroforese em gel de poliacrilamida. Este método permite a separação e a detecção de complexos de proteínas nativas em lisado de tecido não modificada, sem a necessidade de purificação adicional ou puxar-Down.

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Protocolo

1. Preparação do Tecido

1. Preparar 10 ml de 4x tamp de amostra BN-PAGE (Bis 200 mM (2-hidroxietil) metano amino-tris (hidroximetil) (Bis-Tris), NaCl 200 mM, 40% w / v de glicerol, 0,004% de Ponceau S, pH 7,2 ).
   NOTA: esta solução pode ser feita com antecedência e guardadas a 4 ° C.
2. Dilui-se 250 uL de tampão de amostra 4x em 750 uL de _dH2O contendo mistura de inibidores de protease comercial 1x. Vortex e frio no gelo.
3. Homogeneizar 20 mg de tecido alvo no tampão de amostra de 1 mL de 1x gelada BN-PAGE com 30 movimentos de um homogeneizador Dounce limpo.
   NOTA: Para este experimento de demonstração, o tecido alvo é tecido cerebral de ratos todo. Ap homogeneizao, as amostras podem ser tratadas com detergente suave, tal como 2% de digitonina para solubilizar e permitir a electroforese de proteínas de membrana.
4. Transferir o homogeneizado para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, e centrifugar a 14000 xg durante 30 min para sedimentar os conteúdos celulares insolúveis. after centrifugação, decanta-se o sobrenadante para um tubo limpo em gelo.
5. Seguir as instruções do fabricante para medir a concentração de proteína sobrenadante utilizando ácido bicinchonínico (BCA) ou um ensaio de quantificação de proteína semelhante.
6. Se a amostra (s) de homogenado conter detergente, adicionar uma quantidade de 5% de Coomassie Blue G-250 em solução aquosa suficiente para levar a solução homogeneizado a 0,25% de Coomassie.

2. BN-PAGE

1. Dilui-se 25 ml de 20x azul nativa (BN) electroforese estoque de tampão (1,0 M de Bis-Tris, 1,0 M de tricina, pH 6,8) em 475 mL de _dH2O contendo 0,002% de Azul de Coomassie para fazer 500 ml de tamp de corrida 1x.
   1. Se as amostras contêm detergente, em vez disso fazer 250 ml de tamp de corrida 1x contendo 0,02% de Coomassie e mais 250 mL contendo nenhum.
2. tampão (s) frio a 4 ° C.
3. Limpar e montar um gel de poliacrilamida que derrama Cassete de acordo com as instruções do fabricante.
4. Despeje o gel de poliacrilamida BN (3% de camada de empilhamento em T, 6% de camada de resolução T) de acordo com uma receita padrão ⁷ e coloque o pente de poço.
5. Após a polimerização dos géis, enxágüe a cassete com dH2O e monte o aparelho de eletroforese de acordo com as instruções do fabricante.
6. Remova o pente do poço e encha os poços com 1x buffer de execução BN-PAGE. Evite encher toda a câmara interna com tampão até as amostras serem carregadas.
   1. Se as amostras contiverem detergente, encher os poços com o tampão contendo 0,02% de Azul de Coomassie.
      NOTA: Execute os passos 2.7-2.9 a 4 ° C.
7. Usando pontas de carga de gel, pipetar um volume de homogeneizado contendo 20 μg de proteína nos poços desejados. Pipetar um volume equivalente de 1x tampão de amostra BN-PAGE em poços não utilizados.
   NOTA: Utilizar a concentração de proteína determinada a partir do ensaio de BCA para calcular o volume apropriado de homogeneizado a adicionar aos poços.
8. Depois as amostras são carregadas, encher a câmara interior com tampão 1x BN-PAGE em execução. Certifique-se o gel é inteiramente submerso em tampão. Em seguida, encher a câmara exterior com 1x tampão de corrida para o nível indicado pelo fabricante.
   1. Se as amostras contêm detergente, encher a câmara interior com o tampão 1x contendo 0,02% de azul de Coomassie, e a câmara exterior com tampão de corrida 1x isento de corante.
9. Ligar os eléctrodos para a fonte de alimentação, e electroforese as proteínas no gel a 150 V até que a banda de corante progride ~ 2 centímetros em resolver camada. Parar e desligar a alimentação eléctrica.

3. A reticulação

NOTA: Efectuar os Passos 3,1-3,6 a 4 ° C.

1. Desmontar o aparelho de electroforese, e separar as vidraças da cassete de gel. Remover e descartar a camada de empilhamento.
2. Corte cuidadosamente o gel apenas abaixo da aresta inferior da frente do corante. Levaro cuidado de fazer este corte tão lisa e direita quanto possível, e, em seguida, descartar a peça não utilizada do gel. Isto deixará uma ~ 2 cm de largura, tira horizontal em gel de poliacrilamida, que contêm toda a proteína na amostra de homogenato.
3. Aparar quaisquer porções não utilizadas ao longo das bordas da tira de gel.
4. Cuidadosamente colocar a tira em 10 mL de tampão fosfato salino (PBS), em um recipiente pequeno, e misturar suavemente por nutação durante 30 minutos para equilibrar.
5. Após equilíbrio, descartar e substituir o PBS com mais 10 ml. Pipetar 500 L de 25 mM de DSP dissolvido em sulfóxido de dimetilo na PBS, e continuar a misturar como anteriormente (passo 3.4), durante 30 min.
6. Decantar a solução de DSP. Adicionar 10 ml de 0,375 M de tris (hidroximetil) aminometano (Tris-HCl), pH 8,8, contendo 2% de dodecilsulf ato de sódio (SDS) para extinguir o DSP que não reagiu. Continuar nutação durante 15 minutos.

4. SDS-PAGE

1. Enquanto tira de gel é têmpera, preparar SDS-PASoluções de gel GE de acordo com métodos padrão ^9. Não adicione reagentes de polimerização.
2. Após terminar a reacção, voltar a tira de gel ΒΝ até à temperatura ambiente, e fundido a tira dentro de uma nova cassete de gel.
   1. Para fazer isso, cuidadosamente pegar o gel e colocá-lo sobre uma placa de gel de espaçador cassete limpo.
   2. Oriente a tira de modo que a parte inferior da frente do corante é mais próximo à parte superior da nova cassete (ou seja, o lado que viajou mais distante durante BN-PAGE deve ser o mais próximo do topo da nova cassete, a tira de gel deve ser invertida a partir do seu prévio orientação). Ver Figura 3.
   3. Colocar a tira de tal modo que o seu bordo superior encontra-se ainda com que a borda superior da placa de cobertura será (ou seja, ele vai estar no topo do gel de novo). Certifique-se a frente de corante é paralela às bordas horizontais da placa de vidro.
   4. Empurrar um lado da tira excisado contra uma das paredes do espaçador, deixando espaço no tele outro lado para o gel para ser vertida e um padrão de proteína, ou escada para ser carregado.
   5. Se a borda inferior da tira de gel contém quaisquer áreas serrilhadas ou irregulares, cortá-los cuidadosamente distância. Se estiver presente, eles vão bolhas armadilha durante gel de vazamento.
   6. Uma vez que a tira de gel está posicionada correctamente, colocar a placa de cobertura sobre a placa do espaçador. Aplique uma leve pressão para empurrar as bolhas de ar aprisionadas.
   7. Continuar a montar o aparelho que derrama-gel de acordo com as instruções do fabricante.
3. Adicionar reagentes de polimerização para o tampão de gel de resolução, e despeje-a cassete de gel preparada, usando uma pipeta serológica. Encher a cassete de gel a aproximadamente 2 cm abaixo da tira de gel BN-PAGE excisado, para deixar espaço para a camada de empilhamento.
4. Adicionar 100 mL de butanol sobre a parte superior do gel derramado, e permitir 30 min para a polimerização da camada de resolver. Decantar o butanol.
5. Adicionar reagentes de polimerização para a solução de gel de empilhamento. Usando um serologpipeta ical, verter a camada de empilhamento para preencher todo o espaço vazio que permanece na cassete de gel.
   1. Inclinar a cassete de gel, como a camada de empilhamento é derramado de modo a preencher o espaço abaixo da tira de gel, e as bolhas de ar não estão presos.
   2. À medida que o tampão de gel de empilhamento preenche o espaço vazio por baixo da tira de gel, retornar gradualmente a cassete de gel a base de nível.
   3. Continuar a preencher o espaço vazio ao lado da tira de gel excisado com o tampão do gel de empilhamento, até que quase transborda.
6. Permitir que a camada de empilhamento para polimerizar durante 30 minutos.
   NOTA: Adicione 10x SDS-PAGE O tampão de corrida (Tris 250 mM (hidroximetil) aminometano (tris), 1.9 M de glicina, 1% de SDS), enquanto que o gel é a polimerização. Isso também pode ser feito com antecedência e armazenado à temperatura ambiente.
7. Dilui-se 50 mL de 10X de SDS-PAGE estoque tampão de corrida em 450 mL de _dH2O para fazer tampão de trabalho 1x.
8. Depois da camada de empilhamento tem polimerizado, remover a cassete de gel da vertendoaparelho, lavar com dH ₂ O, e montar o aparelho de electroforese de acordo com as instruções do fabricante.
9. Encher a câmara interior completamente com tampão de corrida SDS-PAGE 1x, em seguida, encher a câmara exterior para o nível indicado pelo fabricante.
10. Carregar o espaço ao lado da tira de gel excisada com uma escada de peso molecular ou padrão de proteína apropriada.
11. Anexar os eléctrodos para a fonte de alimentação, e electroforese das amostras a 120 V. Quando o corante de Coomassie corre fora do gel, parar e desligar a fonte de alimentação.
12. Analisar o gel, utilizando métodos padrão de eiectromancheamento e detecção da proteína através da ligação ¹⁰ anticorpo.

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Resultados

Neste experimento de demonstração, multero-PAGE foi realizada em toda lisado cérebro de rato. As proteínas resultantes separadas foram transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno (PVDF), e em seguida sondadas com anticorpos contra proteínas que são conhecidas por formar complexos. A Figura 1 mostra uma validação do protocolo por dois meios. Em primeiro lugar, demonstra-se que as proteínas de ligação cruzada são susceptíveis ao corte por adiç...

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Discussão

interações proteína-proteína são importantes para cada tarefa seres vivos realizar. Devido a isso, eles são objecto de intenso escrutínio e pesquisa. Multímero-PAGE é um novo método para a captura, separar, e a análise de uma grande variedade de complexos de proteínas. Foi anteriormente demonstrado a sua aplicabilidade ao estudo oligimerization da doença associada à proteína α-sinucleína ^11. No entanto, é extensível para muitos complexos de proteína, tal como demonstrado na

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
ε-Aminocaproic acid	Sigma	A2504
Acrylamide	Acros Organics	164855000	Toxic.
Acrylamide/bisacrilamide 37.5:1 (40%T stock solution)	BioRad	161-0148	Toxic.
Ammonium persulfate	Sigma	A3678
Anti rabbit IgG-HRP from goat	Santa Cruz Biotechnology	sc-2004
Bicinchoninic acid assay kit	Thermofisher	23225
Bis-tris	Sigma	B9754
Bovine serum albumin	Sigma	A9647
Butanol	Fisher Scientific	A399-1
Chemiluminescence substrate kit	ThermoFisher	24078
Coomassie blue G-250	Sigma-Aldrich	B0770
Digitonin	Sigma	D141	Toxic.
Dimethyl sulfoxide	Fisher Scientific	D128-1
Dithiobis(succinimidylpropionate)	Thermo Scientific	22585
Dry nonfat milk	LabScientific	M0841
Glycerol	Sigma	G9012
Glycine	Fisher Scientific	BP381-5
Halt Protease Inhibitor Cocktail	Thermofisher	78430
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A144SI-212	For titration. Caustic.
Methanol	Fisher Scientific	A412-4	For PVDF membrane activation. Toxic.
Monoclonal anti α-synuclein IgG from rabbit	Santa Cruz Biotechnology	sc-7011-R
N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine	Sigma	T9281
N,N'-methylenebisacrylamide	Acros Organics	16479	Toxic.
NP40	Boston Bioproducts	P-872
Polysorbate 20 (tween-20)	Fisher Scientific	BP337-500
Polyvinylidene fluoride transfer membranes	Thermo Scientific	88518
Ponceau S	Sigma	P3504
Potassium chloride	Fisher Scientific	P217-3
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P9791
Protease inhibitor cocktail	Thermo Scientific	88265
SDS solution (10% w/v)	BioRad	161-0416
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-212
Sodium dodecyl sulfate	Sigma	L37771
Sodium phosphate monobasic	Fisher Scientific	BP329-1
Tricine	Sigma	T0377
Tris base	Fisher Scientific	BP152-500
Tris-HCl (0.5 M buffer, pH 6.8)	BioRad	161-0799
Tris-HCl (1.5 M buffer, pH 8.8)	BioRad	161-0798
Name	Company	Catalog Number	Comments
Instruments
GE Imagequant LAS 4000	GE Healthcare	28-9558-10
ImageJ software	NIH
Synergy H1 microplate reader	BioTek
Gel Former + Stand	Biorad
Microfuge 22R centrifuge	Beckman Coulter
2 mL dounce homogenizer
Vortex mixer	Fisher Scientific
Ultrasonic tissue homogenizer	Fisher Scientific	FB120220