JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Представлен способ стабилизации и отделения нативных белковых комплексов из немодифицированного тканевого лизата с использованием реакционноспособного по аминогруппе белкового сшивающего агента, связанного с новой двухмерной системой электрофореза в полиакриламидном геле (PAGE).

Аннотация

Есть много хорошо разработанных методов для очистки и изучения одиночных белков и пептидов. Тем не менее, большинство клеточных функций осуществляется сетей взаимодействующих белковых комплексов, которые зачастую трудно исследовать, поскольку их связывания не является ковалентной и легко возмущается методами очистки. Эта работа описывает способ стабилизации и разделения нативные белковые комплексы из немодифицированной ткани с помощью двумерного электрофореза в полиакриламидном геле. Ткань лизат наносили на неденатурирующем сине-родной полиакриламидном геле, а затем электрический ток подается до тех пор, пока белок мигрирует на короткое расстояние в геле. Полоска геля, содержащая перенесенный белок затем вырезала и инкубировала с дитиобисом аминного реакционноспособным сшивающим реагентов (сукцинимидилпропионат), который ковалентно стабилизирует белковые комплексы. Полосы гель, содержащий поперечно-сшитые комплексы затем отливают в сульфат полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия и третон комплексы разделены полностью. Метод основан на методах и материалах, знакомых большинству молекулярных биологов, это означает, что это недорогой и простой в освоении. В то время как он ограничен в своей способности адекватно отделить чрезвычайно крупные комплексы, и не было универсально успешным, метод был в состоянии захватить широкий спектр хорошо изученных комплексов, и, вероятно, применимо ко многим системам, представляющим интерес.

Введение

Нормальная клеточная функция зависит от белок-белковых взаимодействий , 1, 2. В результате болезнь человека часто отмечается возмущениями в сборке и поведении различных белковых комплексов 3. Способность характеризовать такие взаимодействия Поэтому крайне важно. Современные средства обнаружения этих взаимодействий требует очистки белков-мишеней, часто с последующим раскрывающихся их взаимодействующих партнеров. Обычная очистка осуществляется дифференциальным центрифугированием, осаждением и / или хроматографически 4. Эти методы требуют больших затрат времени, должны быть изменены для каждого белка-мишени, и часто приводят к низким выходам. Современные методы очистки включают слияние пептидных тегов белков - мишеней, а затем с помощью иммунопреципитации или экстракции на колонках с грузом шариков , связанных с молекулой захвата 5,«> 6. Хотя это является расширяемым для многих белков, это требует модификации последовательности мишени, что потенциально приводит к конструкции , которые отличаются по сродству для своих обычных партнеров связывания. Деликатный характер некоторых белок-белковых взаимодействий означает , что этот метод не может быть применят для многих сценариев. Кроме того, выпадающие анализы, используемые для сопоставления белок-белковых взаимодействий может не захватывать точную клеточную картину, из-за ограниченных степеней свободы и неместных уровней белка приманки.

В идеале, белковые комплексы могут быть обнаружены в их родных штатах, без необходимости очистки или тянуть вниз. Синий нативный электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ-БН) была разработана в качестве менее денатурирующего электрофореза альтернативы натрия додецилсульфата в полиакриламидном геле (SDS-PAGE), а также позволяет для разделения некоторых белков и комплексов из биологических образцов 7. Однако белки в BN-PAGE с отдельной на основе LARGE число переменных, включая размер, заряд, трехмерную структуру, и ассоциации с другими молекулами. Взаимодействие этих факторов часто приводит к совместному разделению белков, образованию агрегатов, и плохого разрешению полосы белка. Двумерный электрофорез нативной полиакриламидном геле устраняет некоторые, но не все из этих проблем 8.

Для того, чтобы обойти осложнения , связанные с нативным разделением, некоторые авторы используют аминные-реактивные сшивающие реагенты, такие как дитиобис (сукцинимидилпропионат) (DSP), чтобы захватить белковые комплексы в лизатах ткани 4. Эти обработанные лизаты могут быть затем денатурируют и разделяют с помощью ДСН-ПААГ, сохраняя при этом родной размер и состав белковых комплексов. Однако, так как поперечно-сшивающие реагенты реагируют на основе близости от одной молекулы к другой, а также белков в лизатах ткани имеет много степеней свободы, и может взаимодействовать стохастический, неспецифический фон крест-linking может быть высоким, особенно в концентрированных образцах. Это может привести к трудным для интерпретации результатов.

Здесь мы демонстрируют использование способа гибридного БН-PAGE / SDS-PAGE, названный мультимера-электрофорез в полиакриламидном геле (мультимер-PAGE), для разделения и обнаружения белковых агрегатов в сложных смесях. Первоначально, клеточный лизат суспендируют в полиакриламидном геле с помощью BN-PAGE. Лизат-содержащий гель затем подвергают взаимодействию с реагентом DSP сшивания. Псевдо-иммобилизованных и слегка разделенные на геле, белки гораздо реже реагируют неспецифически, а это означает фон кросс-линкер реакционная способность снижается. После сшивания, гель полосы вырезают и разделяли с помощью SDS-PAGE. Полученный гель затем могут быть проанализированы с помощью любых средств, обычно связанных с электрофорезом в полиакриламидном геле. Этот метод позволяет для разделения и обнаружения нативных белковых комплексов в лизате немодифицированной ткани, без необходимости дополнительной очистки или PULL-Дауп.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Подготовка ткани

  1. Подготовьте 10 мл 4x BN-PAGE буфера для образцов (200 мМ бис (2-гидроксиэтил) амино-трис (гидроксиметил) метан (Bis-Tris), 200 мМ NaCl, 40% вес / объем глицерина, 0,004% Ponceau S, рН 7,2 ).
    Примечание: Этот исходный раствор может быть изготовлен заранее и хранили при 4 ° С.
  2. Разбавляют 250 мкл 4х буфера для образца в 750 мкл дН 2 O , содержащей 1x коммерческий коктейль ингибитора протеазы. Vortex и холод на льду.
  3. Однородные 20 мг ткани-мишени в 1 мл 1x охлажденного льда BN-PAGE образец буфере с 30 ударами чистого Даунсом гомогенизатора.
    Примечание: Для этого демонстрационного эксперимента, ткань-мишени цела ткань мозга крысы. После гомогенизации, образцы могут быть обработаны с мягким моющим средством, такими как 2% дигитониной для солюбилизации и разрешить электрофорез мембранных белков.
  4. Передача гомогената в 1,5 мл микроцентрифужных трубки и центрифуги при 14000 мкг в течение 30 мин для осаждения нерастворимых клеточного содержимого. Afteг центрифугирование, декантируют надосадочную жидкость в чистую пробирку на льду.
  5. Следуйте инструкции производителя для измерения надосадочной концентрации белка с использованием бицинхониновой кислоты (BCA) или аналогичного анализа белка количественного определения.
  6. Если образец (ы) гомогената содержит моющее средство, добавить количество 5% кумасся голубой G-250 в водном растворе, достаточном для доведения раствора гомогената до 0,25% кумасся.

2. BN-PAGE

  1. Развести 25 мл 20x синие родные (BN) электрофорез буфера запас (1,0 М Bis-Tris, 1,0 М трицина, рН 6,8) в 475 мл дНы 2 O , содержащих 0,002% Кумасся синим , чтобы сделать 500 мл 1x подвижным буфер.
    1. Если образцы содержат моющие средства, вместо того, чтобы сделать 250 мл 1x подвижным буфер, содержащим 0,02% кумасся и еще 250 мл, не содержащих ни одного.
  2. Холод буфер (ы) до 4 ° С.
  3. Очистить и собрать полиакриламидного геля разливочный кассету в соответствии с инструкциями производителя.
  4. Налейте BN полиакриламидном геле (3% слой Т укладки, 6% Т разрешение слоя) в соответствии со стандартным рецептом 7, и поместите гребень хорошо.
  5. После того , как гели полимеризуется, промыть кассету с дН 2 O и собрать устройство электрофореза в соответствии с инструкциями производителя.
  6. Снимите гребень хорошо и заполнить лунки 1x BN-PAGE проточного буфера. Избегайте заполнения всю внутреннюю камеру с буфером до тех пор , пока будут загружены образцы.
    1. Если образцы содержат моющее средство, заполняют скважины с буфером, содержащим 0,02% кумасси синим.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги 2.7-2.9 при 4 ° С.
  7. С помощью гель-погрузочных советов, пипетки объема гомогенаты, содержащих 20 мкг белка в желаемых скважины. Пипетировать эквивалентный объем 1x BN-PAGE образца буфера в любые неиспользованные лунки.
    Примечание: Используйте концентрацию белка определяется из анализа BCA для вычисления соответствующего объема гомогената, чтобы добавить клунки.
  8. После того, как будут загружены образцы, заполнить внутреннюю камеру с 1x БН-ПААГ рабочего буфера. Убедитесь , что гель полностью погружен в буфер. Затем заполнить внешнюю камеру с 1x Проточный буфер до уровня , указанного изготовителем.
    1. Если образцы содержат моющее средство, заполнить внутреннюю камеру с буфером, содержащий 1x 0,02% кумасся синим, и внешней камерой с 1x красителей подвижного буфером.
  9. Подключение электродов к источнику питания, и electrophorese белки в геле при 150 В до тех пор, пока полоса красителя прогрессирует ~ 2 см в решении слой. Остановить и отключить электропитание.

3. Сшивание

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги 3.1-3.6 при 4 ° С.

  1. Разберите аппарат электрофореза, а также отдельные листы стекла геля кассеты. Удаляют штабелирования слой.
  2. Тщательно вырезать гель чуть ниже нижнего края переднего красителя. приниматьзаботиться, чтобы сделать это сокращение, как гладкий и прямой, насколько это возможно, а затем выбросить неиспользованный кусок геля. Это оставит широкие ~ 2 см, горизонтальную полосу полиакриламидный геля, который будет содержать все белка в образце гомогенаты.
  3. Срежьте любые неиспользованные части вдоль краев полосы геля.
  4. Осторожно поместите полоску в 10 мл физиологического раствора с фосфатным буфером (PBS) в небольшой контейнер, и осторожно перемешать нутации в течение 30 мин для уравновешивания.
  5. После уравновешивания, выбросить и заменить PBS с еще 10 мл. Пипетка 500 мкл 25 мМ ЦОС, растворенного в диметилсульфоксиде в PBS, и продолжают смешивание, как описано выше (этап 3.4) в течение 30 мин.
  6. Вылейте раствор DSP. Добавляют 10 мл 0,375 М трис (гидроксиметил) аминометана гидрохлорид (Трис-HCl), рН 8,8, содержащим 2% додецилсульфата натрия (SDS) для гашения непрореагировавшего DSP. Продолжить нутации в течение 15 мин.

4. SDS-PAGE

  1. В то время как гель полосы закалки, готовят SDS-PAГелевые растворы GE в соответствии со стандартными методами 9. Не добавляйте реагенты полимеризации.
  2. После закалки, возвращают гель полоску $ N до комнатной температуры, и бросают полосу в новый гель кассеты.
    1. Для этого тщательно подобрать гель и поместите его на чистую гель кассеты распорной пластины.
    2. Восток полоса так дно фронта красителя находится ближе к верхней части новой кассеты (то есть сторона , которая путешествовала дальше всего в течение BN-PAGE должна быть ближе к верхней части новой кассеты; гель полоска должна быть перевернута от ее до ориентация). Смотри рисунок 3.
    3. Поместите полоску так , что ее верхний край лежит даже когда верхний край крышки будет (т.е., это будет в верхней части нового геля). Убедитесь, что передняя красителя параллельно горизонтальных края стеклянной пластины.
    4. Нажмите одну сторону вырезанной полосы против одного из разделительных стенок, оставляя место на тс другой стороны, он для геля, чтобы вылить и стандартный белок или лестницы должны быть загружены.
    5. Если нижний край полоски геля содержит любые неровные участки, тщательно вырезать их. Если присутствует, то они будут пузыри ловушки во время заливки геля.
    6. Как только гель полоса в правильном положении, лежали крышку над разделительной пластиной. Применить мягкое давление, чтобы вытолкнуть любые захваченные пузырьки воздуха.
    7. Продолжить, чтобы собрать гель-заливки устройства в соответствии с инструкциями производителя.
  3. Добавьте реагенты полимеризации в геле разрешающего буфера, и вылить ее в подготовленную гель кассеты, с помощью серологической пипетки. Заполните гель кассету до ~ 2 см ниже вырезанной BN-PAGE гель-полоски, чтобы оставить место для укладки слоя.
  4. Добавьте 100 мкл бутанол поверх залитого геля, и позволить 30 мин для полимеризации разрешающего слоя. Слить бутанол.
  5. Добавьте реагенты полимеризации в раствор штабелирования геля. Использование serologскую пипетку, влить штабелирования слой, чтобы заполнить все оставшееся пустое пространство в гелевой кассете.
    1. Наклон гель кассеты как штабелирование слой сливают, так что оно заполняет пространство ниже полосы геля, а воздушные пузырьки не зажаты.
    2. По мере того как буфер концентрирующий гель заполняет пустое пространство под полосой гель, постепенно возвращают гель кассету для уровня фундамента.
    3. Продолжить, чтобы заполнить пустое пространство рядом с вырезанным гелем полосы с буфером укладки геля, пока он почти переполнением.
  6. Дайте штабелирование слой полимеризуется в течение 30 мин.
    Примечание: Сделать 10x SDS-PAGE рабочего буфера (250 мМ трис (гидроксиметил) аминометан (TRIS), 1,9 М глицина, 1% ДСН), в то время как гель полимеризации. Это также можно сделать заранее и хранить при комнатной температуре.
  7. Развести 50 мл 10X SDS-PAGE работает в буферном запасе 450 мл дНы 2 O , чтобы сделать 1x рабочего буфера.
  8. После того, как штабелирование слой полимеризуется, удалите гель кассету из заливкиУстройство, промыть дН 2 O, и собрать устройство электрофореза в соответствии с инструкциями производителя.
  9. Заполните внутреннюю камеру полностью с 1x SDS-PAGE проточной буфера, а затем заполнить наружную камеру до уровня, указанного производителем.
  10. Загрузите пространство рядом с вырезанным гелем полосы с молекулярной лестницей веса или соответствующим белковым стандартом.
  11. Присоедините электроды к источнику питания, и electrophorese образцов при 120 В. Когда краситель Кумасси стекает гель, остановить и отключить электропитание.
  12. Анализ геля с помощью стандартных методов Электроблоттинга и детекции белка путем связывания антитела 10.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

В этом демонстрационном эксперименте мультимер-PAGE проводили на всем лизате мозга крысы. Полученные в результате этого выделенные белки переносили на поливинилиденфторид дифторида (PVDF) мембраны, а затем зондировали с использованием антител против белков, которые, ка?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Белок-белковые взаимодействия являются важными для каждой задачи живых существ выполнять. Из-за этого, они являются предметом пристального внимания и исследования. Мультимер-страница представляет собой новый способ для захвата, разделения и анализа широкого спектра белковых комплек...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Поддерживается DA034783 NIH / NIDA. Мы благодарим Брайан А. Киллингера за техническую помощь с мультимерами-ПААГОМ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals
ε-Aminocaproic acidSigmaA2504
AcrylamideAcros Organics164855000Toxic.
Acrylamide/bisacrilamide 37.5:1 (40%T stock solution)BioRad161-0148Toxic.
Ammonium persulfateSigmaA3678
Anti rabbit IgG-HRP from goatSanta Cruz Biotechnologysc-2004
Bicinchoninic acid assay kitThermofisher23225
Bis-trisSigmaB9754
Bovine serum albuminSigmaA9647
ButanolFisher ScientificA399-1
Chemiluminescence substrate kitThermoFisher24078
Coomassie blue G-250Sigma-AldrichB0770
DigitoninSigmaD141Toxic.
Dimethyl sulfoxideFisher ScientificD128-1
Dithiobis(succinimidylpropionate)Thermo Scientific22585
Dry nonfat milkLabScientificM0841
GlycerolSigmaG9012
GlycineFisher ScientificBP381-5
Halt Protease Inhibitor CocktailThermofisher78430
Hydrochloric acidFisher ScientificA144SI-212For titration. Caustic.
MethanolFisher ScientificA412-4For PVDF membrane activation. Toxic.
Monoclonal anti α-synuclein IgG from rabbitSanta Cruz Biotechnologysc-7011-R
N,N,N',N'-tetramethylethylenediamineSigmaT9281
N,N'-methylenebisacrylamideAcros Organics16479Toxic.
NP40Boston BioproductsP-872
Polysorbate 20 (tween-20)Fisher ScientificBP337-500
Polyvinylidene fluoride transfer membranesThermo Scientific88518
Ponceau SSigmaP3504
Potassium chlorideFisher ScientificP217-3
Potassium phosphate monobasicSigmaP9791
Protease inhibitor cocktailThermo Scientific88265
SDS solution (10% w/v)BioRad161-0416
Sodium chlorideFisher ScientificBP358-212
Sodium dodecyl sulfateSigmaL37771
Sodium phosphate monobasicFisher ScientificBP329-1
TricineSigmaT0377
Tris baseFisher ScientificBP152-500
Tris-HCl (0.5 M buffer, pH 6.8)BioRad161-0799
Tris-HCl (1.5 M buffer, pH 8.8)BioRad161-0798
NameCompanyCatalog NumberComments
Instruments
GE Imagequant LAS 4000GE Healthcare28-9558-10
ImageJ softwareNIH
Synergy H1 microplate readerBioTek
Gel Former + StandBiorad
Microfuge 22R centrifugeBeckman Coulter
2 mL dounce homogenizer
Vortex mixerFisher Scientific
Ultrasonic tissue homogenizerFisher ScientificFB120220

Ссылки

  1. Alberts, B. The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists. Cell. 92 (3), 291-294 (1998).
  2. Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes Dev. 14 (9), 1027-1047 (2000).
  3. Rual, J. F., et al. Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network. Nature. 437 (7062), 1173-1178 (2005).
  4. Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiol Rev. 59 (1), 94-123 (1995).
  5. Ho, Y., et al. Systematic identification of protein complexes in Saccharomyces cerevisiae by mass spectrometry. Nature. 415 (6868), 180-183 (2002).
  6. Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).
  7. Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
  8. Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
  9. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  10. Beisiegel, U. Protein Blotting. Electrophoresis. 7 (1), 1-18 (1986).
  11. Killinger, B. A., Moszczynska, A. Characterization of alpha-Synuclein Multimer Stoichiometry in Complex Biological Samples by Electrophoresis. Anal Chem. 88 (7), 4071-4084 (2016).
  12. Newman, A. J., Selkoe, D., Dettmer, U. A new method for quantitative immunoblotting of endogenous alpha-synuclein. PLoS One. 8 (11), e81314(2013).
  13. Wong, S. S. Chemistry of protein conjugation and cross-linking. , CRC Press. Boca Raton. (1991).
  14. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  15. Tanford, C., Reynolds, J. A. Characterization of membrane proteins in detergent solutions. Biochim Biophys Acta. 457 (2), 133-170 (1976).
  16. Peters, K., Richards, F. M. Chemical cross-linking: reagents and problems in studies of membrane structure. Annu Rev Biochem. 46, 523-551 (1977).
  17. Lomant, A. J., Fairbanks, G. Chemical probes of extended biological structures: synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S]dithiobis(succinimidyl propionate). J Mol Biol. 104 (1), 243-261 (1976).
  18. Sun, F., et al. Crystal structure of mitochondrial respiratory membrane protein complex II. Cell. 121 (7), 1043-1057 (2005).
  19. Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

123

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены