微孔阵列平台中微生物群落发展的组装与跟踪

摘要

微生物群落的发展取决于环境结构，成员丰度，特征和相互作用等因素的结合。该协议描述了一种合成的微制造环境，用于同时跟踪包含在femtoliter井中的数千个社区，其中可以近似关键因素，如利基尺寸和约束。

摘要

微生物群落的发展取决于复杂的确定性和随机因素的组合，可以显着改变社区成员的空间分布和活动。我们开发了一个微孔阵列平台，可用于并行快速组装和跟踪数千个细菌群落。该协议强调了该平台的实用性，并描述了其用于光学监控平台内阵列集合内简单的两人社区的发展。该示范使用铜绿假单胞菌的两个突变体，一系列突变体的一部分用于研究VI型分泌致病性。 mCherry或GFP基因的染色体插入片促进具有不同发射波长的荧光蛋白的组成型表达，可用于监测每个微孔内的群落成员丰度和位置。该协议描述了详细的方法d用于将细菌混合物组装到阵列的孔中，并使用延时荧光成像和定量图像分析来测量每个成员群体随时间的相对增长。微孔平台的种植和组装，阵列内微生物群落定量分析所需的成像过程以及可用于揭示微生物物种区域之间相互作用的方法。

引言

微生物群落由细胞死亡，分裂，蛋白质浓度，细胞器数目和突变^1相关的环境结构和随机过程两个决定因素构成。在自然环境中，几乎不可能分析这些影响对社区组成和活动的个人影响。被自然结构遮蔽，埋在化学和生物环境中，识别社区成员并进一步解决其在自然环境中的时空分布是极具挑战性的。尽管如此，最近的努力已经强调了空间组织对社区功能的重要性，并指出在正在进行的研究2,3,4中需要考虑成员丰富和组织。

它很清楚，当地的化学环境（ 即营养物质和次生代谢物的可获得性），物理结构（ 如土壤结构，植物根系，海洋颗粒或肠道微绒毛），氧气的存在或不存在以及引入致病物种都影响微生物群落5,6,7,8,9,10,11的组成，结构和功能。然而，忽视捕捉这些因素的传统文化技术依然存在。社区组成（ 例如，共同依赖物种的存在），物理附着，信号分子浓度和直接的细胞 - 细胞接触都是形成微生物群落的重要因素，并且可能在c传统文化条件。这些性质难以在大量液体培养物或琼脂平板上复制。然而，允许复制自然环境的关键物理和化学特征的微流体，微图形化和纳米制造技术的可用性使得许多研究人员能够建立细菌群落来研究它们的相互作用^{12,13,14 ，}并开发合成环境模拟自然条件4，15，16，17，18，19，20。

该协议描述了一种制造微孔阵列器件的方法，并提供了可用于功能化th的详细实验程序e井在阵列中生长细菌，作为单一物种殖民地和多成员社区。这项工作还演示了如何使用细菌修饰以产生荧光报告蛋白可以随时间监测孔内的细菌生长。以前提出了类似的阵列，并且显示可以在微孔中跟踪绿脓假单胞菌（ 铜绿假单胞菌）单种群的生长。通过调节孔径和接种密度，数千个生长实验的起始条件可以并行变化，以确定初始接种条件如何影响细菌生长的能力²¹ 。目前的工作使用微型阵列的稍微修改版本，其基于以前的工作，通过实现多个阵列的同时比较和使用更强大的实验协议。此工作中使用的数组包含多个子阵列或阵列包含不同尺寸的直径为15-100μm的孔，其以三个不同的间距（ 即孔径的2x，3x和4x）排列。将阵列蚀刻到硅中，并且通过用已经用中等浸渍的琼脂糖凝胶涂覆的盖玻片密封阵列来实现在硅阵列中接种的细菌的生长。用于研究VI型分泌系统的铜绿假单胞菌突变体用于该示范。

这里提出的结果构建在分析微孔阵列中的多元群落的最终目标，使研究人员能够在控制和探测化学环境的同时监测原位细菌的丰度和组织。这应该最终提供洞察管理社区发展和继承的"规则"。

研究方案

硅微孔阵列制造

1. 聚对二甲苯涂层
   1. 根据制造商的规格和说明书（设置:蒸发器设定点= 160℃;炉设定点= 650℃），使用市售的聚对二甲苯涂层系统在硅晶片上沉积1-1.5μm的聚对二甲苯N.
      注意:装入室内的聚对二甲苯约6克产生1-1.5微米厚的涂层。
2. 光刻
   1. 以3,000rpm转速涂覆具有粘合促进剂，20％六甲基二硅氮烷（HMDS）和80％丙二醇单甲醚乙酸酯（PGMEA）（ 参见表材料 ）的聚对二甲苯N-包覆的晶片45秒。用粘合促进剂填充2 mL转移移液管，并将其洒在整个晶片上。让晶片静置约10秒，然后将其干燥。
   2. 填充2毫升转移移液器与正（参见"材料表" ），并将光致抗蚀剂分配在晶片的中心。以3,000rpm旋转45秒以产生约1.5μm厚的抗蚀剂涂层。
   3. 将样品在115℃的电热板上软烘烤1分钟。
   4. 使用具有所需孔图案的接触对准器和光掩模将样品暴露于紫外线。通过图案化的光掩模将旋涂的晶片暴露6秒，给出在365nm处测量的约60-80mJ / cm ²的近似剂量。
   5. 通过将样品浸在显影剂（<3％四甲基氢氧化铵在水中;参见材料表 ）2分钟来显影图案 。用去离子水冲洗并用干净的氮气干燥。
      注意:在开发过程中应清除暴露于紫外线的光致抗蚀剂区域。
3. 反应离子蚀刻
   1. 使用氧等离子体蚀刻去除暴露的聚对二甲苯一路到硅衬底。
      注意:可以调节配方以改变聚对二甲苯的蚀刻速率。对于1和5μm之间的聚对二甲苯厚度，在反应离子蚀刻（RIE）工具上使用60 mTorr，20°C，100 sccm O 2，10 W RF和2,000 W ICP的配方。在蚀刻和去除暴露的聚对二甲苯层之后，图案化区域（ 即暴露的硅）应该看起来有光泽和银色。
   2. 使用深度RIE（DRIE; 例如 Bosch DRIE）蚀刻工艺来蚀刻到硅中。
      注意:蚀刻速率和持续时间将决定井深。 Bosch工艺的一个完整周期（3s沉积步骤:20mTorr，15℃，140sccm C ₄ F 8,10W RF和1,750W ICP，随后10秒蚀刻工艺:20mTorr，15℃ ，120sccm SF 6,8W RF和1,750W ICP）对应于约1μm的蚀刻深度。该演示中使用的井深为3 - 3.5μm。
   3. V使用物理轮廓测量法蚀刻蚀刻深度。
      1. 将样品加载到物理轮廓仪中（参见材料表 ）。
      2. 打开样品真空并按手动装载按钮。
      3. 通过按"对焦"按钮将系统对准样品。在视图屏幕上放置适当的测量功能。
      4. 扫描样品。调整轮廓并测量特征深度。
      5. 记录蚀刻速率并调制后续蚀刻时间以达到所需的深度。
         注意:测量将包括硅阱的深度，沉积的聚对二甲苯的厚度和光致抗蚀剂的厚度。在整个过程中验证每层的厚度是实现精确井深所必需的。

2.细菌培养和播种（ 图1a ）

1. 在Luria Broth（LB）来自甘油储备的琼脂平板，并在两周内使用。从LB琼脂平板上挑选所需菌株的菌落，并开始铜绿假单胞菌的过夜培养。在37℃下孵育过夜培养约18小时，同时在R2A培养基中以220rpm摇动。
   注意:应在接种后两周内挑选菌落，以确保突变和荧光报告基因被保留。所有铜绿假单胞菌工作应在BSL-2条件下进行。
2. 使用金刚石刻字将硅晶片分成含有不同尺寸和间距阵列的组合的单个芯片。确保每个芯片包含完整的孔尺寸和间距用于研究。

图1:制作和细胞播种程序。 （ a ）微孔阵列a重新蚀刻成涂有薄层聚对二甲苯（i）的硅晶片。为了润湿孔和/或使表面官能化，将蛋白质溶液加入到阵列顶部的液滴中（ii）。去除蛋白质溶液，将晶片干燥，并加入含有所需细菌的新溶液（iii）。在培养期后除去细菌溶液，使晶片干燥，留下孔中和表面上的细菌（iv）。用聚对二甲苯剥离除去表面相关细菌，留下细菌在微孔中干净地播种，由于2％甘油培养基仍然存活，这有助于保持孔水合（v）。然后将硅芯片阵列侧放置在琼脂糖凝胶涂覆的玻璃盖玻片上，其在微孔（vi）中进行细菌生长。 （ b ）在单个硅器件上布置子阵列。每个子阵列包含一组相同的孔。所有sub-a上的微孔的直径阵列的直径范围为5-100μm，组织为井口直径的2x，3x或4x，这在底板示意图上由白色至深灰色表示。当深度浅（<10μm）时，5和10μm的孔直径很少有用，通常是因为缺乏细胞定植这些非常小的孔。在这项工作中，仅分析了直径为15-100μm的井的数据。 请点击此处查看此图的较大版本。

注意: 如图1b所示 ，一个完整的芯片包含直径范围从5到100μm的孔的子阵列，具有三个不同的间距（ 即 2x，3x和4x直径），重复4次。

3. 将500μL/ mL牛血清白蛋白（BSA）的150μL液滴放入PBS溶液中在阵列顶部润湿微孔。在室温下将BSA溶液在芯片上孵育1小时。
   1. 通过用磷酸盐缓冲盐水（PBS）填充空的移液器吸头盒的底部来创建腔室。
      注意:其他物质，如特异性凝集素，可用于代替BSA功能化微孔表面。
4. 在将硅芯片与BSA溶液一起孵育的同时，以2500rpm（相当于950×g的平均值）离心培养物5分钟，然后将其重新悬浮于500μL具有2％甘油的新鲜R2A培养基中。
   1. 使用紫外可见分光光度计在600 nm处测定培养物的OD。使用2％甘油R2A培养基将其调节至0.02。
      注意:甘油有助于防止在聚对二甲苯剥离过程中油井变干。
5. 孵育后，取出BSA溶液，用PBS冲洗3次，取出并更换液体喷雾管覆盖硅微孔阵列。在氮气下干燥。
6. 向放置在潮湿室中的每个干阵列中加入150μL0.02 OD培养物。在4℃下孵育1小时以使细菌粘附到井壁上。
   注意:孵化不需要制冷。 4℃的孵育时间可用于在成像开始之前防止细菌的生长，以便人们可以在生长前观察群落的空间组织。也可以使用室温孵育。两种方案都产生类似的生长曲线。

3.显微镜设置

1. 在硅片开始细菌培养之前，打开舞台顶部的环境控制室（参见表格）并调整控制箱上的设置，使湿度（〜100％）和温度（30-32 °C，参见步骤3.2）可以在添加样品之前平衡。
2. 对样品架进行调平并将其插入使用PBS浸泡的实验室擦拭物（参见"材料表" ），在样品周围，将室内的湿度增加到露点。将腔室的温度设置为30°C，将腔室温度设置为32°C，以减少成像平面上的冷凝。
   注意:滑块固定器安装在带有约1厘米厚的垫圈的活细胞室中。借助放置在样品架顶部的气泡水平，样品架平整。样品架可以稍微倾斜，并保持密封在垫圈中。
3. 当文化孵化在硅芯片上时，在成像前至少30分钟手动打开汞灯的电源开关。手动打开相机和自动显微镜舞台。打开用于控制显微镜和外围设备的软件，并确保软件识别设备。
   注意:放大倍数为10倍，NA = 0.3。

4。制备琼脂糖玻璃盖玻片

1. 微波预先制备的琼脂糖溶液（ 即 R2A培养基中的2％琼脂糖）直到达到液体状态，大约60s。
2. 用75毫米x 22毫米的＃1.5玻璃盖玻片用乙醇将背面浸湿，将其纵向放置在2×3"（50 x 75 mm）的玻璃载玻片上，放置两个PDMS垫片（厚度〜1 mm）沿着盖玻片的长边缘移动玻璃盖玻片，使得大约1mm的盖玻片突出于滑块的边缘。
3. 将5 mL液体琼脂糖溶液倒入玻璃盖玻片顶部，刚好足以完全覆盖，并将第二个2 x 3"玻璃载玻片放置在组件的顶部，将盖玻片和滑块之间的液体琼脂夹在中间。
   注意:这可以控制琼脂糖的深度，使盖玻片和硬化琼脂糖的总厚度与PDMS间隔物的厚度相等。
4. 允许玻片载玻片 - 盖玻片 - 琼脂糖凝胶 - 玻璃夹层板，直到琼脂糖溶液开始固化;然后将其转移到冰箱。 15分钟后，取出多余的固体琼脂糖并切割玻璃盖玻片。将其移动到干净的盘子上并放置在冰箱中直到使用。

5.用琼脂糖涂层盖片和成像法密封孔

1. 细菌孵育完成后，从冰箱中取出琼脂糖包覆的盖玻片，制备硅片，如下。
   1. 将硅片浸入超纯水中，每次一片，每次10s。将它们放在实验室擦拭物或组织的边缘上，直到大部分多余的液体从芯片的边缘排出。
   2. 切割一块胶带以匹配每个硅芯片的边缘长度。将胶带放在覆盖硅的聚对二甲苯上，并用它快速剥离聚对二甲苯涂层。
   3. IMMED将每个剥离的芯片反转并放置每个芯片，使得微孔阵列侧面（并与之接触）琼脂糖涂覆的盖玻片的琼脂糖层。在接触琼脂糖后，小心不要移动或移动芯片，以防止孔外的细菌生长。
2. 将组装好的微孔阵列/琼脂糖盖玻片放置在扫描仪上的台顶环境控制室的滑块架上。
   1. 使用环境光或定向光（ 例如手电筒）来定位感兴趣的阵列。使用控制自动化阶段的商业软件来保存这些职位（见材料表）。储存位置后，请关闭环境或指示灯。
   2. 在商业软件中，打开"ND采集"面板。
      注意:该面板包括一个用于自动保存到特定目录的菜单，以及可编程图像采集。对于这些实验使用"时间"，"XY"和"λ"菜单。
   3. 要在软件中保存位置，请单击"XY菜单"，然后在需要保存的每个位置上检查左侧的空白框。另外，点击"Include Z"按钮。
3. 使用适当的荧光过滤器立方体，在所需波长和10倍放大倍数下随时间获取图像（参见材料表）。
   1. 使用控制软件和保存的阵列位置移动到每个保存的位置并专注于井。点击保存的列表中的每个XY位置，并使用绿色荧光蛋白（GFP）过滤器调整焦点。通过单击指向z位置的箭头来保存新的z位置。
      注意:此过程可能很耗时。考虑采取增加增益的预防措施，并使用中性密度滤光片降低光线强度，以防止光漂白。
   2. 通过在聚焦在阵列表面上注意z轴位置的差异来确定每个波长的焦平面之间的z轴距离。使用红色荧光蛋白（RFP）过滤器，从混合的红色/绿色细菌群体中选择2-3个位置，并使用焦点。
      1. 使用GFP和RFP荧光滤光器减去焦平面之间的距离，并在"λ"菜单下添加焦平面调整。
         注意:例如，如果阵列在50nm的z位置聚焦在GFP通道中，并且相同的阵列在RFP通道中以55μm出现聚焦，则在"λ"中的RFP光学配置旁边加上+5 "菜单。
   3. 开始延时图像采集。
      注意:对于本文所示的实验，使用多维图像采集通过控制的商业软件，以30分钟的间隔为每个阵列位置获取RFP和GFP图像相机，快门，滤光轮和电动舞台。
      1. 将"间隔"设置为30分钟，将"实验持续时间"设置为"时间"菜单下的24小时。点击"立即运行"。
         注意:在"时间"，"XY"和"λ"框被选中的情况下，运行该程序会将舞台移动到每个位置（ 即保存的XYZ位置）上，拍摄一个波长的图像，移动z-位置考虑焦平面差异（ 即 λ或波长控制），取第二个图像，移动到下一个阵列位置（多点），并以30分钟间隔（延时）循环。
4. 获取照明控制图像。
   注意:使用"ND采集"，"时间"和"XY"菜单拍摄4个位置的图像，每个位置为25x。
   1. 通过关闭所有光源和摄取，拍摄一系列100"暗场"图像标准幻灯片的"图像"。这些图像将捕获相机噪音。使用时间段内使用的最长曝光时间（步骤5.3.3）。
   2. 通过在几个不同位置成像标准幻灯片（ 即均匀RFP或GFP强度）来拍摄一系列100"照明场"图像，以捕获在给定实验条件下的不均匀照明。选择最大化信号而不达到饱和的曝光时间。

分析

1. 使用图像分析软件（ 例如， ImageJ）处理图像堆栈。
   1. 使用商业软件将获取的图像转换为tiff文件格式。通过点击"文件">"导入">"图像序列"将图像上传到图像分析软件中。
   2. 通过对所有"暗场"和"照明场"图像进行平均，创建"校正图像"。 Subtrac通过选择"处理">"图像计算器"，平均"照明场"图像的平均"暗场"图像。在"操作"字段中选择"Image1"和"Image2"两个图像，然后选择"Subtract"。点击"确定"。
      1. 对于平均，加载校正（或暗场）图像，单击"图像">"堆叠">"Z项目">"平均投影"。
   3. 必要时进行图像注册。然后，通过点击"处理">"减去背景"来执行背景减法。在"半径"字段中输入半径（ 例如 125），然后选择"滑动抛物面"。
   4. 使用"Process">"Calculator Plus"进行照明校正。选择以下参数:操作，划分; i1，形象好i2，校正图像; k1，校正图像平均值;和k2，0.单击"Cre"吃新窗口"。
      注意:该数据集不需要注册，但在其他工作中，ImageJ插件StackReg与"翻译"转换一起使用。对于背景减法，对每个图像集使用相同的滑动抛物面半径。例如，如果成像的最大的孔的像素半径为100，则对每个图像组使用大于100的半径（ 例如， 125）。
2. 确定微孔中每个菌株的生长。
   1. 使用ImageJ"MicroArray"插件在所需阵列中的每个微孔周围选择感兴趣区域（ROI）。
      1. 在"MAP"菜单中，单击"重置网格"。指定行，列和直径（根据阵列上的孔尺寸和数量），请参见图1b 。从"ROI形状"菜单中选择"圆"。
      2. 按住"Alt"键，同时用鼠标移动t选择左上角的ROI他的ROI数组。按住"shift"键，同时选择左下角的ROI可以更改阵列的大小。按住"shift"键，同时从阵列右侧选择一个ROI，而不是在角落，以改变ROI的间距。
      3. 使用上述命令将ROI阵列适合图像中的孔。点击"测量RT"。
         注意:插件将从每个ROI导出所需的测量值。使用三个ROI大小，在井周围产生同心环，以收集局部背景信号（ 即，从外环减去的中间环的信号）和荧光测量（ 即来自内环的信号）。
   2. 在电子表格软件中收集数据并计算背景信号。将其导入自定义脚本软件进行进一步分析。
3. 数据组织与分析
   1. 导入数据并组织数据在ImageJ中以下列顺序收集到ImageJ中的矩阵:列1，子数组号;第2列，井排;第3栏，井柱;第4栏，平均强度;第5栏，背景强度;和第6列，平均强度 - 背景强度。
      1. 将mCherry和GFP获取的结果分成不同的矩阵。将每个子阵列和每个颜色的结果存储在单元格阵列中的不同单元格中。
         注意:该组织使得在图像数据和测量结果之间来回移动更简单，清理数据并确保测量准确地表示数据。
   2. 调整铜绿假单胞菌的自发荧光 。
      注意:在涉及GFP和mCherry菌株的共培养的实验中，应该分析一种仅限于氯化胆碱的芯片，以确定mCherry和绿色自发荧光之间的关系。
      1. 绘制所有mCherryΔretS的mCherry-GFP信号，＃916; tse / i1-6所有时间点的孔，以确定mCherry信号和GFP通道中的自发荧光之间的关系。从共培养物中减去自发荧光信号。
   3. 绘制轨迹并将修改后的逻辑方程拟合到每个轨迹，以便使用电子表格软件或自定义脚本软件中的最小二乘法提取参数。
   4. 寻找GFP和mCherry轨迹参数之间的相关性。

结果

这里提出的实验平台是为细菌群落的高通量和高含量研究而设计的。该设计使得能够同时分析成千上万个种植在各种尺寸的井中的社区。通过这种微孔阵列设计，可以确定最终社区组成对初始播种密度，孔尺寸和化学环境的依赖性。这项工作展示了微型阵列中两个成员社区的发展，并提出了分析社区组成和组织的方法。

这里?...

讨论

本文介绍了微孔阵列设备和实验方案，旨在实现基于细胞群发展的高通量和高含量的基于活细胞成像的分析。虽然这里的示范重点是研究接触介导的VI型分泌对社区发育的影响，但阵列被设计为灵活的，适应于广泛的微生物群落和微生物 - 微生物相互作用的研究。这里的工作仅在于使用组成性表达荧光标记物的细菌，以便容易地跟踪成员丰度和位置。然而，通过改变化学环境，通过生长或扰动后?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Parylene N	Specialty Coating Systems	CAS NO.:1633-22-3
Parylene coater	Specialty Coating Systems	Labcoter 2 Parylene Deposition Unit PDS2010
Silicon Wafer	WRS Materials	100mm diameter, 500-550μm thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100>,
adhesion promoter	Shin-Etsu Microsci	MicroPrime P20 adhesion promoter
postive tone photoresist	Rohm and Haas Electronics Materials LLC (Owned by Dow)	Microposit S1818 Positive Photoresist (code 10018357)
Quintel Contact Aligner	Neutronix Quintel Corp	NXQ 7500 Mask Aligner
Reactive Ion Etching Tool	Oxford Instruments	Plasmalab System 100 Reactive Ion Etcher
R2A Broth	TEKnova	R0005
Bovine Serum Albumin	Sigma	A9647
Multimode Plate Reader	Perkin Elmer	Enspire, 2300-0000
Fluorescent Microscope	Nikon	Eclipse Ti-U
Automated Stage	Prior	ProScan III
CCD camera	Nikon	DS-QiMc
Stage-top environmental control chamber	In Vivo Scientific	STEV ECU-HOC
Phosphate Buffered Saline	ThermoFisher Scientific	14190144
UltraPure Agarose	ThermoFisher Scientific	16500500
25 x 75 mm No. 1.5 coverslip	Nexterion	High performance #1.5H coverslips
Fluorescence Reference Slides	Ted Pella	2273
Physical Stylus Profilometer	KLA Tencor	P-6
lab wipes	Kimberly Clark	Kimipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155
commercial software	Nikon	NIS Elements
Zeiss 710 Confocal Microscope	Zeiss
filter cubes	Nikon	Nikon FITC (96311), Nikon Texas Red(96313)