A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
הפיתוח של קהילות חיידקים תלוי בשילוב של גורמים, כולל אדריכלות סביבתית, שפע חבר, תכונות, ואינטראקציות. פרוטוקול זה מתאר סביבה סינתטי, microfabricated למעקב בו זמנית של אלפי קהילות הכלול בארות femtoliter, שבו גורמים מרכזיים כגון גודל נישה כליאה ניתן בקירוב.
הפיתוח של קהילות חיידקים תלוי בשילוב של גורמים דטרמיניסטיים וסטוכסטיים מורכבים שיכולים לשנות באופן דרמטי את ההתפלגות המרחבית ואת פעילותם של חברי הקהילה. פיתחנו פלטפורמת מערך microell שניתן להשתמש בה במהירות להרכיב ולעקוב אחר אלפי קהילות חיידקים במקביל. פרוטוקול זה מדגיש את השירות של הפלטפורמה ומתאר את השימוש שלה עבור ניטור אופטי של פיתוח של קהילות פשוטות, שתי חברות בתוך אנסמבל של מערכים בתוך הפלטפורמה. הדגמה זו משתמשת בשני מוטציות של Pseudomonas aeruginosa , חלק מסדרה של מוטציות שפותחו כדי לחקור פתוגניות של סוג VI. הוספת כרומוזומלית של גנים mCherry או GFP או להקל על הביטוי המכונן של חלבונים ניאון עם אורכי גל פליטה שונים שניתן להשתמש בהם כדי לפקח על שפע הקהילה ואת המיקום בתוך microwell. פרוטוקול זה מתאר מת 'מפורטד להרכבת תערובות של חיידקים לתוך הבארות של המערך ושימוש זמן לשגות הדמיה פלואורסציה ניתוח כמותי התמונה כדי למדוד את הצמיחה היחסית של כל אוכלוסייה חבר לאורך זמן. זריעה והרכבה של פלטפורמת microwell, ההליכים הדמיה הכרחי לניתוח כמותי של קהילות חיידקים בתוך המערך, ואת השיטות שניתן להשתמש בהם כדי לחשוף אינטראקציות בין מינים באזור מינים כל דנו.
קהילות מיקרוביאליות מעוצבות על ידי גורמים דטרמיניסטיים, כגון מבנה הסביבה ותהליכים סטוכסטיים, הקשורים למוות תאים, חלוקה, ריכוז חלבון, מספר האברונים, ומוטציה 1 . בתוך הסביבה הטבעית, זה כמעט בלתי אפשרי לנתח את ההשפעה הפרטנית של השפעות אלה על הרכב הקהילה ופעילותה. המסתתרים על ידי מבנים טבעיים ונקברים בתוך סביבה כימית וביולוגית, זיהוי חברי הקהילה והמשך פתרון הפיצול הספטיוטמפוראלי שלהם בתוך הסביבה הטבעית הם מאתגרים ביותר. עם זאת, המאמצים האחרונים הדגישו את חשיבותו של הארגון המרחבי על תפקוד הקהילה והצביעו על הצורך לתת דין וחשבון על שפע הארגון וארגונו במחקרים מתמשכים 2 , 3 , 4 .
זהברור כי הסביבה הכימית המקומית ( כלומר , הזמינות של חומרים מזינים וחילוף חומרים משני), המבנה הפיזי ( למשל, ארכיטקטורה של אדמה, שורשי צמחים, חלקיקי האוקיינוס או מיקרוביילי המעי), נוכחות או היעדר חמצן והכנסת מינים פתוגניים משפיעים על הרכב, ארכיטקטורה ותפקוד של קהילות מיקרוביאליות 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . עם זאת, טכניקות מסורתיות עבור תרבויות הזנחה ללכוד גורמים אלה ממשיכים לגבור. הרכב הקהילה ( למשל, נוכחות של מינים תלויי תלות), התקשרות פיזית, ריכוז מולקולה איתות, קשר ישיר תא סלולרי הם כל הגורמים החשובים לעיצוב קהילה חיידקים והוא יכול ללכת לאיבוד גתנאי התרבות האונבנציונלית. מאפיינים אלה קשה לשכפל בתרבות נוזלי בתפזורת או על צלחת אגר. הזמינות של טכניקות microfluidic, micropatterning ו- nanofabrication המאפשרות שכפול של תכונות פיסיקליות וכימיות עיקריות של סביבות טבעיות אפשרה לחוקרים רבים לבנות קהילות חיידקים כדי לחקור את האינטראקציות שלהם 12 , 13 , 14 ולפתח סביבות מלאכותיות לחקות את התנאים הטבעיים 4 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 .
פרוטוקול זה מתאר שיטה לפברק מכשיר מערך microell ומספק נהלים ניסיוניים מפורט שניתן להשתמש בהם כדי פונקציונליE wells במערך לגדל חיידקים, הן כמושבות יחיד מינים בקהילות מרובות חברים. עבודה זו גם ממחישה כיצד חיידקים שונה כדי לייצר חלבונים הכתב ניאון ניתן להשתמש כדי לפקח על צמיחה חיידקים בתוך בארות לאורך זמן. מערך דומה הוצג בעבר הראה כי ניתן לעקוב אחר הצמיחה של מינים בודדים מינים של Pseudomonas aeruginosa ( פ aeruginosa) ב microwells. על ידי שינוי גודל וצפיפות זריעה היטב, התנאים ההתחלתיים של אלפי ניסויים הצמיחה יכול להיות מגוונות במקביל כדי לקבוע כיצד תנאי חיסון ראשוני להשפיע על היכולת של חיידקים לגדול 21 . העבודה הנוכחית משתמשת בגירסה שונה מעט של מערך microwell אשר בונה על העבודה הקודמת בכך שהוא מאפשר השוואה בו זמנית של מערכים מרובים באמצעות פרוטוקול ניסיוני חזק יותר. המערך שבו נעשה שימוש בעבודה זו מכיל מספר תת-מערכות משנה, או מערך אנסםBles, המכיל בארות בגדלים שונים, הנעים בין 15-100 מיקרומטר בקוטר, אשר מסודרים על שלוש זפות שונות ( כלומר 2x, 3x, ו 4x קוטר). מערכים הם חרוט לתוך סיליקון, ואת הצמיחה של חיידקים seeded במערכי הסיליקון מאופשר על ידי איטום מערכים עם coverslip כי כבר מצופה עם ג'ל agarose בינונית חדורים. P. aeruginosa מוטנטים שנועדו ללמוד את מערכת הפרשת סוג VI משמשים בהפגנה זו.
התוצאות המוצגות כאן לבנות לקראת המטרה האולטימטיבית של ניתוח קהילות multimember בתוך מערכים microwell, המאפשר לחוקרים לפקח על שפע וארגון של חיידקים באתרם תוך שליטה וחוקר הסביבה הכימית. זה צריך בסופו של דבר לספק תובנות את "הכללים" אשר קובעים פיתוח הקהילה ואת הירושה.
1. Silicon Microwell- מערך ייצור
2. תרבות חיידקים זריעת ( איור 1 א )
איור 1: ייצור ו Cell זרע נוהל. ( א ) מערכי Microell אנחרט מחדש לתוך פרוסות סיליקון מצופה בשכבה דקה של parylene (i). כדי להרטיב את הבארות ו / או פונקציונלי את פני השטח, פתרון חלבון מתווסף טיפה על גבי מערכים (ii). הפתרון חלבון מוסר, ופלים מיובשים, וכן פתרון חדש המכיל את החיידקים הרצוי נוסף (iii). הפתרון החיידקי מוסר לאחר תקופת הדגירה, ופלים מותר להתייבש, משאיר מאחוריו חיידקים בבארות ועל פני השטח (iv). החיידקים הקשורים משטח מוסרים עם parylene להרים- off, משאירים מאחור חיידקים seeded נקי microells ועדיין קיימא בשל בינוני גליצרול 2%, אשר מסייע לשמור על בארות hydrated (V). שבבי סיליקון ממוקמים מכן בצד מערך למטה על agarose ג'ל מצופה coverslip זכוכית, אשר מזין צמיחה חיידקים microwells (vi). ( ב ) פריסת תת מערכים על מכשיר סיליקון יחיד. כל מערך משנה מכיל קבוצה של בארות זהות. הקוטר של microwells בכל תת-אRrays טווח בקוטר של 5-100 מיקרומטר מאורגנים ב 2x, 3x, או 4x את הקוטר היטב המגרש, אשר מסומן על ידי לבן כדי אפור כהה צבעים על לוחית הסכימה התחתונה. כאשר מעמקי הבאר הם רדודים (<10 מיקרומטר), 5 ו 10 מיקרומטר היטב בקטרים מועילים לעתים נדירות, בדרך כלל בגלל חוסר תאים ליישב אלה בארות קטנות מאוד. בעבודה זו, רק את הנתונים מבארות עם 15-100 קוטר מיקרומטר נותחו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
הערה: כפי שמוצג בתרשים 1b , שבב מלא מכיל מערכי משנה של בארות, בקוטר שבין 5 ל 100 מיקרומטר, עם שלוש זפות שונות ( כלומר 2x, 3x, 4x קוטר) חוזר 4 פעמים.
3. מיקרוסקופ הגדרת
Class = "jove_title"> 4. הכנת Agarose מצופה זכוכית Coverslips
5. איטום וולס עם Coverslip ו- Agarose מצופה הדמיה
6. ניתוח
הפלטפורמה הניסויית המוצגת כאן מיועדת לתפוקה גבוהה ולחקר תוכן גבוה של קהילות חיידקים. התכנון מאפשר לנתח בו זמנית אלפי קהילות, הגדלות בארות בגדלים שונים. עם עיצוב מערך microwell זה, את התלות של הרכב הקהילה הסופי על צפיפות זריעת הראשונית, גם גודל, סביבה כימ?...
מאמר זה הציג מכשיר מערך microell ופרוטוקולים ניסיוניים שנועדו לאפשר תפוקה גבוהה תוכן גבוהה לחיות תא הדמיה מבוסס ניתוח של פיתוח הקהילה חיידקים. בעוד שמיקוד ההפגנה כאן היה לבחון את ההשפעות של הפרשת סוג 6 על פיתוח הקהילה, המערכים נועדו להיות גמישים ולהתאים את המחקר למגוון ר...
למחברים אין מה לחשוף.
מערכים Microwell היו מפוברקות מאופיין במרכז חומרים Nanophase מדעי משתמש מתקני החטיבה, משרד בסיסי מדעי האנרגיה, מחלקת האנרגיה של ארה"ב. תמיכה כספית לעבודה זו נמסרה באמצעות Oak Ridge National Laboratory מנהל מחקר ופיתוח הקרן. המחברים גם רוצים להודות למעבדה ג 'יי מוגז (אוניברסיטת וושינגטון, סיאטל, WA) על אספקת זנים פ aeruginosa המשמשים מחקרים אלה.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Parylene N | Specialty Coating Systems | CAS NO.:1633-22-3 | |
Parylene coater | Specialty Coating Systems | Labcoter 2 Parylene Deposition Unit PDS2010 | |
Silicon Wafer | WRS Materials | 100mm diameter, 500-550μm thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100>, | |
adhesion promoter | Shin-Etsu Microsci | MicroPrime P20 adhesion promoter | |
postive tone photoresist | Rohm and Haas Electronics Materials LLC (Owned by Dow) | Microposit S1818 Positive Photoresist (code 10018357) | |
Quintel Contact Aligner | Neutronix Quintel Corp | NXQ 7500 Mask Aligner | |
Reactive Ion Etching Tool | Oxford Instruments | Plasmalab System 100 Reactive Ion Etcher | |
R2A Broth | TEKnova | R0005 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | |
Multimode Plate Reader | Perkin Elmer | Enspire, 2300-0000 | |
Fluorescent Microscope | Nikon | Eclipse Ti-U | |
Automated Stage | Prior | ProScan III | |
CCD camera | Nikon | DS-QiMc | |
Stage-top environmental control chamber | In Vivo Scientific | STEV ECU-HOC | |
Phosphate Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
UltraPure Agarose | ThermoFisher Scientific | 16500500 | |
25 x 75 mm No. 1.5 coverslip | Nexterion | High performance #1.5H coverslips | |
Fluorescence Reference Slides | Ted Pella | 2273 | |
Physical Stylus Profilometer | KLA Tencor | P-6 | |
lab wipes | Kimberly Clark | Kimipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155 | |
commercial software | Nikon | NIS Elements | |
Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss | ||
filter cubes | Nikon | Nikon FITC (96311), Nikon Texas Red(96313) |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved