Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
Развитие микробных сообществ зависит от сочетания факторов, включая экологическую архитектуру, численность членов, черты и взаимодействия. В этом протоколе описывается синтетическая микроструктурированная среда для одновременного отслеживания тысяч сообществ, содержащихся в ямах фемтолитера, где могут быть аппроксимированы ключевые факторы, такие как размер ниши и ограничение.
Развитие микробных сообществ зависит от сочетания сложных детерминированных и стохастических факторов, которые могут кардинально изменить пространственное распределение и деятельность членов сообщества. Мы разработали платформу массива microwell, которая может использоваться для быстрой сборки и отслеживания тысяч бактериальных сообществ параллельно. В этом протоколе подчеркивается полезность платформы и описывается ее использование для оптического мониторинга развития простых сообществ из двух членов в составе массивов в рамках платформы. Эта демонстрация использует два мутанта Pseudomonas aeruginosa , часть серии мутантов, разработанных для изучения патогенности секреции типа VI. Хромосомные вставки генов mCherry или GFP облегчают конститутивную экспрессию флуоресцентных белков с четкими длинами волн излучения, которые могут использоваться для мониторинга численности и местоположения членов сообщества в каждом микролухе. Этот протокол описывает подробный методD для сборки смесей бактерий в лунки массива и использования временной флуоресцентной визуализации и количественного анализа изображений для измерения относительного роста популяции каждого члена с течением времени. Посев и сборка платформы microwell, процедуры визуализации, необходимые для количественного анализа микробных сообществ внутри массива, и методы, которые могут быть использованы для выявления взаимодействий между областью микробных видов, обсуждались.
Микробные сообщества формируются как детерминированными факторами, такими как структура окружающей среды, так и стохастическими процессами, которые связаны с гибелью клеток, делением, концентрацией белка, количеством органелл и мутацией 1 . В естественной среде практически невозможно проанализировать индивидуальное воздействие этих влияний на состав и деятельность сообщества. Замаскированные естественными структурами и погребенные в химической и биологической среде, выявление членов сообщества и дальнейшее разрешение их пространственно-временного распределения в естественной среде чрезвычайно сложны. Тем не менее, недавние усилия подчеркнули важность пространственной организации для функционирования сообщества и указывают на необходимость учета как численности, так и организации в текущих исследованиях 2 , 3 , 4 .
ЭтоЯсно, что локальная химическая среда ( то есть доступность питательных веществ и вторичных метаболитов), физическая структура ( например, почвенная архитектура, корни растений, частицы океана или кишечные микроворсинки), наличие или отсутствие кислорода и введение Патогенные виды влияют на состав, архитектуру и функцию микробных сообществ 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . Тем не менее традиционные методы для культур, которые пренебрегают этим фактором, продолжают преобладать. Состав сообщества ( например, наличие со-зависимых видов), физическое прикрепление, концентрация сигнальной молекулы и прямой контакт клеток-клеток являются важными факторами формирования микробного сообщества и могут быть потеряны в cОбщепринятые условия культивирования. Эти свойства трудно реплицировать в объемной жидкой культуре или на агаровой пластине. Тем не менее, наличие микрофлюидных, микронапряжений и технологий нанообработки, которые позволяют реплицировать ключевые физические и химические свойства природных сред, позволило многим исследователям построить сообщества бактерий для изучения их взаимодействий 12 , 13 , 14 и разработать синтетические среды, которые Имитировать природные условия 4 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 .
В этом протоколе описан способ изготовления устройства массива микроволн и подробные экспериментальные процедуры, которые могут быть использованы для функционализацииE колодцев в массиве и выращивать бактерии, как колонии одного вида, так и в сообществах с несколькими членами. Эта работа также демонстрирует, как бактерии, модифицированные для получения флуоресцентных репортерных белков, могут использоваться для мониторинга роста бактерий в лунках с течением времени. Аналогичный массив был представлен ранее и показал, что можно отслеживать рост одновидовых колоний Pseudomonas aeruginosa ( P. aeruginosa) в микролунках. Путем модуляции плотности и плотности посева начальные условия тысяч экспериментов по росту могут варьироваться параллельно, чтобы определить, как исходные условия инокуляции влияют на способность бактерий расти 21 . Текущая работа использует слегка измененную версию массива микроячейки, которая основывается на предыдущей работе, позволяя одновременное сравнение нескольких массивов и используя более надежный экспериментальный протокол. Массив, используемый в этой работе, содержит несколько подмассивов или массивСодержащие лунки разного размера, от 15 до 100 мкм в диаметре, которые расположены на трех разных смолах ( т.е. 2x, 3x и 4x диаметр скважины). Массивы выгравированы в кремнии, а рост бактерий, засеянных в кремниевых массивах, обеспечивается запечатыванием массивов с покровным стеклом, покрытым агарозным гелем с средней интенсивностью. В этой демонстрации используются мутанты P. aeruginosa, предназначенные для изучения системы секреции типа VI.
Представленные здесь результаты направлены на достижение конечной цели анализа сообществ многочленов в массивах матриц микроволн, что позволяет исследователям контролировать численность и организацию бактерий in situ , контролируя и исследуя химическую среду. Это должно в конечном итоге дать представление о «правилах», которые регулируют развитие и преемственность сообщества.
1. Изготовление матрицы из микроволнового кремния
2. Бактериальная культура и сеяние ( рис. 1а )
Рисунок 1: Процесс изготовления и сортировки ячеек. ( A ) Массивы MicrowellРектифицированных в кремниевые пластины, покрытые тонким слоем парилена (i). Для смачивания лунок и / или функционализации поверхности раствор белка добавляется в каплю поверх массивов (ii). Раствор белка удаляют, вафли сушат и добавляют новый раствор, содержащий искомые бактерии (iii). Бактериальный раствор удаляют после инкубационного периода, и вафли дают высохнуть, оставляя бактерии в лунках и на поверхности (iv). Поверхностно-ассоциированные бактерии удаляются с выделением парилена, оставляя позади бактерии, засеянные чисто в микролунках, и все еще жизнеспособны из-за 2% -ной глицериновой среды, что помогает удерживать лунки гидратированными (v). Затем кремниевые чипы размещают на стороне массива на покрытом агарозным гелеобразным стеклянным покровным стеклом, который питает бактериальный рост в микролунах (vi). ( Б ) Макет поддиапазонов на одном кремниевом устройстве. Каждый суб-массив содержит набор одинаковых скважин. Диаметр микролунков по всем суб-аДиапазоны в диапазоне от 5 до 100 мкм и организованы в 2x, 3x или 4x шаг диаметра скважины, который обозначен белым или темно-серым цветом на нижней панели. Когда глубина скважины неглубокая (<10 мкм), диаметры отверстий 5 и 10 мкм редко используются, как правило, из-за отсутствия клеток, колонизирующих эти очень маленькие лунки. В этой работе были проанализированы только данные из скважин диаметром 15-100 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
ПРИМЕЧАНИЕ. Как показано на рисунке 1b , полный чип содержит подвалы колодцев с диаметром от 5 до 100 мкм с тремя разными смолами ( т.е. 2x, 3x и 4x диаметр), повторяющимися 4 раза.
3. Настройка микроскопа
5. Уплотнение колодцев покрытием с агарозным покрытием и визуализацией
6. Анализ
Представленная здесь экспериментальная платформа предназначена для высокопроизводительных и высококонцентрированных исследований бактериальных сообществ. Этот проект позволяет одновременно анализировать тысячи сообществ, растущих в лунках разного размера. При ...
В этой статье представлено устройство с микроволновыми решетками и экспериментальные протоколы, предназначенные для высокопроизводительного и высокоточного анализа изображений на основе живых клеток на основе бактериальных сообществ. В то время как в центре внимания демонстрации ?...
Авторам нечего раскрывать.
Массивы Microwell были сфабрикованы и охарактеризованы в Отделе пользовательских услуг Центра нанофазных материалов, Управление по основным энергетическим наукам Министерства энергетики США. Финансовая поддержка этой работы была оказана через Фонд исследований и развития директора Национальной библиотеки Оук-Ридж. Авторы также хотели бы поблагодарить лабораторию J. Mougous (Вашингтонский университет, Сиэтл, штат Вашингтон) за поставку штаммов P. aeruginosa, используемых в этих исследованиях .
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Parylene N | Specialty Coating Systems | CAS NO.:1633-22-3 | |
Parylene coater | Specialty Coating Systems | Labcoter 2 Parylene Deposition Unit PDS2010 | |
Silicon Wafer | WRS Materials | 100mm diameter, 500-550μm thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100>, | |
adhesion promoter | Shin-Etsu Microsci | MicroPrime P20 adhesion promoter | |
postive tone photoresist | Rohm and Haas Electronics Materials LLC (Owned by Dow) | Microposit S1818 Positive Photoresist (code 10018357) | |
Quintel Contact Aligner | Neutronix Quintel Corp | NXQ 7500 Mask Aligner | |
Reactive Ion Etching Tool | Oxford Instruments | Plasmalab System 100 Reactive Ion Etcher | |
R2A Broth | TEKnova | R0005 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | |
Multimode Plate Reader | Perkin Elmer | Enspire, 2300-0000 | |
Fluorescent Microscope | Nikon | Eclipse Ti-U | |
Automated Stage | Prior | ProScan III | |
CCD camera | Nikon | DS-QiMc | |
Stage-top environmental control chamber | In Vivo Scientific | STEV ECU-HOC | |
Phosphate Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
UltraPure Agarose | ThermoFisher Scientific | 16500500 | |
25 x 75 mm No. 1.5 coverslip | Nexterion | High performance #1.5H coverslips | |
Fluorescence Reference Slides | Ted Pella | 2273 | |
Physical Stylus Profilometer | KLA Tencor | P-6 | |
lab wipes | Kimberly Clark | Kimipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155 | |
commercial software | Nikon | NIS Elements | |
Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss | ||
filter cubes | Nikon | Nikon FITC (96311), Nikon Texas Red(96313) |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены