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摘要

本方法用于确定亚型特异性抑制剂组蛋白去乙酰化酶 (HDAC) 在 HeLa 细胞中由多个基板 UHPLC 气相色谱-质谱分析。这是一种抗体免费的方法，开发以反映生活的 HDAC1 和 HDAC6 活性与单一异构体无细胞检测的细胞环境。

摘要

寻找新的组蛋白去乙酰化酶 (HDAC) 抑制剂是提高药物发现感兴趣。异构体选择性以来，在聚光灯下的 romidepsin，一类批准我 HDAC 抑制剂用于癌症治疗和 HDAC6 特异性抑制剂对多发性骨髓瘤的临床研究。本方法用于确定测试化合物 HDAC1 和 HDAC6 细胞的抑制活性。使用超高性能液相色谱 — — 质谱 (UHPLC-MS) 分析方法对特定的底物与处理和未经处理的 HeLa 细胞培养，测定了异构体活性。该方法的优点是反映内的细胞环境，与无细胞的生化研究孤立异构体的内源性 HDAC 活动。此外，因为它基于定量化合成基质，方法不需要内源性乙酰化蛋白抗体识别。它很容易适用于几种细胞系和一个自动化的过程。该方法已经证明有用找到 HDAC6 选择性化合物在神经母细胞。代表性的结果如下所示的标准的 HDAC 抑制剂曲 （非特定），MS275 （特定的 HDAC1） 和 tubastatin （HDAC6-特定） 使用 HeLa 细胞。

引言

乙酰属于一个家庭能够脱乙酰度内的染色质结构的组蛋白的酶。他们还在胞浆内有其他蛋白质底物和位于中各单元格舱室。共 18 HDAC 异构体迄今为止识别出已涉及到几种细胞机制，包括转录因子基因的表达，以及细胞信号转导的调控和运输1，，23，4，5，，67。催化 HDAC 抑制剂已成为潜在的治疗药物，用于治疗癌症。大多数的 HDAC 抑制剂，目前被 FDA 批准为 T 细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤的治疗，非特定 HDAC 抑制剂，如 vorinostat (SAHA)、 belinostat 和 panobinostat8，9。然而，一系列的副作用已与泛-抑制剂和亚型特异性小分子搜索是一个热门话题，在药物化学、 新药开发。因此，类我 （HDAC1 3 和 HDAC8） 选择性抑制剂 romidepsin 是已经核准的药物10，而 HDAC6 特异性抑制剂，目前正在进行的临床实验，在多发性骨髓瘤11，，1213，，1415增加治疗潜力。

筛查检测来表征 HDAC 抑制剂都基于 HDAC 基板与酶源 （单一异构体、 核提取物或细胞裂解液） 的孵化。承印物上通常是含耦合到裂解荧光 （例如，香豆素），乙酰基赖氨酸残基的小分子多肽序列，如 N-(4-methyl-7-aminocoumarinyl)-Nα-(t-butoxycarbonyl)-Nω-acetyllysineamide (MAL)16。为了区分异构体的具体活动，涉及每个异构体的分离无细胞化验是必要和可能不会反映在活细胞中的真正异构体活动。异构体特定底物市面上，如苄基 (S)-[1-(4-methyl-2-oxo-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)-5-propionylaminopentyl]carbamate (MOCPAC，HDAC1 具体基板) 和 (S)-[5-acetylamino-1-(2-oxo-4-trifluoromethyl-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)pentyl]carbamic 酸叔丁酯 (BATCP，HDAC6 具体基板) (图 1B)。然而，仲裁法 》 的多基质混合物中，MOCPAC 和 BATCP 给活细胞将不允许个别的脱乙酰度产品检测荧光法测定，既然他们承担相同的裂解荧光。

这里介绍的方法可以检测和相对定量方法的每个衬底和 HeLa 细胞使用紧接着 UHPLC-质谱-质谱分析17多底物测定其脱乙酰基的产品。HDAC 检测被进行对 HeLa 细胞能够直接识别的 HDAC 抑制活性和特异性的测试化合物对内源性乙酰。那里是专注于 HDAC1 和 HDAC6，同时评估。为了实现在单一孵化测定这些酶法测量，非异性和特异性 HDAC 基质混合物被添加到在 96 孔板上镀的处理和未经处理 HeLa 细胞。后孵化的一步，细胞的裂解释放基质和他们各自的反应产物，这分离和检测 UHPLC 气相色谱-质谱法 (图 1)。仲裁法 》，MOCPAC 和 BATCP 的底物的脱乙酰度的产品分别是脱乙酰度的玛 (dMAL)、 脱乙酰度的 MOCPAC (dMOCPAC) 和脱乙酰度的 BATCP (dBATCP)。剂量-反应曲线可以用活性的化合物。

figure-introduction-2055
图 1: 基于单元格的 HDAC 法通过多个基板 UHPLC 气相色谱-质谱分析鉴定特定于 HDAC1 和 HDAC6 抑制剂的一般计划。(A) 计划的典型 96 孔板化合物治疗 （测试） 和 HeLa 细胞 （对照），以及无细胞的空白。(B) 补充说: 作为一种混合物 (每个 21 µ M)，由内源性乙酰脱乙酰基底的化学结构。(C) 典型 UHPLC-质谱联用色谱显示添加衬底 （仲裁法 》，MOCPAC 和 BATCP） 和脱乙酰度的产品的峰值 (dMAL，dMOCPAC，和 dBACTP，分别)。请点击这里查看此图的大版本。

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研究方案

1.细胞培养

注: 在标准组培罩执行以下步骤。不育技术熟悉预计。

  1. 文化 80%融合在 T75 细胞培养瓶中补充含 10%胎牛血清，青霉素 G 的 MEM HeLa 细胞 (100 U/mL)，和链霉素 （100 毫克/毫升）。
    注: 细胞培养、 治疗和裂解步骤在层流流动，与细胞孵育步骤在执行 5%CO2在无菌条件下湿大气中的 37 ° C 下进行。
  2. 洗细胞两次将 5 毫升、 吸出新方案，和添加 1 毫升的细胞分离试剂。5 分钟来分离细胞，37 ℃ 培养。
  3. 添加 9 毫升的 MEM 培养基、 彻底重悬细胞，和用血球计数器单元格进行计数。
  4. 调整到 MEM 6 x 104细胞/毫升细胞悬浮液的密度。
  5. 向控件添加 100 μ L 细胞悬液并测试井的不育、 平底、 组培治疗 96 孔板 （图 1A）。
  6. 将 100 μ L 的 MEM 培养基添加到空白井的 96 孔板 (图 1A)。
  7. 孵育 96 孔板在 37 ° C 为 24 小时。
    注意: 24 小时孵化是适当时候，以便在 HeLa 细胞中的内源性 HDAC 活性的试验。不同的细胞类型与未知 HDAC 活性可能需要控制细胞 timecourse 评价。

2.细胞治疗试验化合物与 HDAC 基板

  1. 吸出的 96 孔板油井介质。
  2. 添加 25 µ L 的 2 x 测试化合物(例如，曲古菌素 A，MS275 和 tubastatin A) 在 MEM 测试井。添加到控制和空白井的 MEM 25 微升。
    注: 测试化合物的浓度是进行调整，以提供一系列的至少 5 最终测试浓度 （井每一个浓度）。二甲基亚砜中复合测试最终的含量应不超过 0.5%，应该是相同的每个井，包括空格和控制。最后孵化量每井 50 µ L。在从 500 到 1.95 5 浓度测试曲毫微米 （1:4 稀释）。MS275 和 tubastatin A 测试 5 浓度从 8000 至 6.17 毫微米 （1:6 稀释）。对于每个测试复合所需的最后测试浓度应测定每个用户通过创建一个剂量-反应曲线。
  3. 添加到控制和测试井 25 微升的基材混合物 (仲裁法 》、 42 µ M 的 MOCPAC，和 BATCP 在 MEM 42 μ M 42 µ M)。添加空白井的 MEM 25 微升。
    注: 最终每个底物浓度的是 MOCPAC 和 BATCP 分别区分 HDAC1 和 HDAC6 的活动，(图 1B)。 21 µ M。当没有活动观察那些基板时，仲裁法 》 的使用可能潜在活动反对另一个 HDAC 异构体的标识了。
  4. 孵育 96 孔板在 37 ° C 的湿化液的 5 %8 h CO2孵化器。
    注: 此孵育时间适合 HeLa 细胞和允许内源性的 HDAC 与合成基质进行交互。不同的细胞株可能需要在孵化时间和/或底物浓度的调整。

3.细胞裂解和 UHPLC-质谱-质谱样品制备

注意: 样品制备步骤使用有机化学品，是高度易燃和有毒通过摄入或吸入。穿适当的个人防护，如手套、 安全眼镜。

  1. 添加 10 微升 6 x RIPA 缓冲区 （从 10 x RIPA 缓冲液稀释） 辅以每口井的 96 孔板的蛋白酶抑制剂。
  2. 通过添加每口井的冷乙腈 160 µ L 停止反应和混合吹打向上和向下。
    注意: 在-20 ° C 在这一步之前保持乙腈。
  3. 将盘子放在-80 ° C 冰箱 10 分钟。
  4. 从冰箱里删除板和 220 µ L 的每口井的内容转移到非无菌的锥底 （V 形底） 96 孔板。离心板 5000 x g 和 10 分钟 4 ° C。
    注: 此步骤旨在消除蛋白质和盐。如有必要，解决方案可以转移到个人的锥形离心管前离心或过滤通过一套 0.65 微米聚偏氟乙烯滤板 96 孔板。成功清除的沉淀是需要在 UHPLC 分析之前。
  5. 上清液 （或过滤） 200 微升转入 96 孔板与 UHPLC 系统兼容和密封用可剥性、 热封箔使用板封口机。
    注意: 避免吹打颗粒时去除上清液。如果无法立即执行 UHPLC 分析，板可以直到分析存储在 4 ° C，最长为 24 小时。

4.UHPLC/质谱-质谱分析

  1. 来填补它与流动相系统 （95%A:5 %b) 准备 UHPLC 系统:
    答: H2O，高效液相色谱级含 0.1%甲酸 （准备 1 L）
    B: 乙腈、 高效液相色谱法等级、 含 0.1%甲酸 （准备 1 升）。
    注意: 移动相含有有机化学品，是高度易燃和有毒通过摄入或吸入。穿适当的个人防护，如手套、 安全眼镜。
  2. 放入示例管理器包含一个板持有人 96 孔板。运行根据表 1中提供的 UHPLC-质谱-质谱条件示例。
    注意: 分析 96 孔板每一列应该有一个控制井和一个空白井 （板方案的图 1A所示）。控件是活性的代表 100%测试的细胞系中，酶而空白有检查是否 MS 源活性的提供一致的背景。在一个给定的空白中检测到的不寻常 MS 峰应调查以防止 MS 灵敏度变化。

5.数据分析

  1. 与适当的 UHPLC 集成软件集成山顶区的每个底物和其脱乙酰基的产物。
    注意: 使用自动集成参数平滑法 （均值、 窗口大小 3 和数目光滑 2，例如）。使用表 1中规定的色谱条件，洗脱顺序是 dMAL （5.8 分钟）、 dBATCP （6.0 分）、 dMOCPAC （6.2 分）、 仲裁法 》 （7.6 分钟）、 MOCPAC （8.9 分） 和 BATCP （9.8 分钟），如图 1所示。
  2. 对于每种基材，计算峰面积比值 （脱乙酰/乙酰化） 在每个色谱 （测试和控制样品）。
  3. 计算每个测试样本的 HDAC 抑制百分比:
    figure-protocol-3028
    注: HDAC1 抑制使用计算峰面积比值的 dMOCPAC/MOCPAC;HDAC6 抑制被计算 dBATCP/BATCP。可以用比 dMAL / 仲裁法 》，来表达一般 HDAC 抑制。

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结果

能够识别中的应用方法非选择性和选择性抑制剂为 HDAC1 （第一类） 和 HDAC6 （类 IIb），HeLa 细胞治疗与已知的标准化合物: 曲古菌素 A （非选择性 HDAC1 和 HDAC6 之间）18、19MS275 （HDAC1 选择性抑制剂） 和 tubastatin （HDAC6 选择性抑制剂）20。使用本方法 (图 1)，IC50值可以直接确定在活细胞中 HD...

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讨论

HDAC 抑制是一个热门话题，药物发现，当前的重点放在为癌症治疗21HDAC6 选择性抑制剂。HDAC 选择性通常是由一系列的高吞吐量、 无细胞化验，打算对个别 HDAC 异构体21抑制效价评定的。然而，一种抑制剂的选择性必须另外确认在活细胞中通过评估内源性蛋白质底物，如组蛋白的乙酰化状态 （为 I 类乙酰） 和微管蛋白 （为 HDAC6)。因此，细胞化验涉及抗体识别 ?...

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披露声明

作者没有透露。

致谢

作者承认成本行动 CM1406 （表观遗传化学生物学）。研究报告在这份出版物由皮埃尔 · 米谢尔基金会支持。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
BATCPSigma-AldrichB4061
MALSigma-AldrichSCP0168Synonym: BOC-Ac-Lys-AMC
MOCPACSigma-AldrichM2195
MS275Sigma-AldrichEPS002
Trichostatin ASigma-AldrichT8552
Tubastatin ASigma-AldrichSML0044
Acetonitrile, HPLC gradeFisher Scientific10660131
Formic acid, LC/MS gradeFisher Scientific10596814
H2O, HPLC gradedistilled H2O filtered through a Milli-Q purification system
HeLa cellsATCCATCC CRM-CCL-2
Cell dissociation reagent TrypLE ExpressThermoFisher Scientific12604013
DMSO, cell culture gradeApplichem146463
DPBSThermoFisher Scientific14190144
Fetal bovine serumBiowestS1810
MEMThermoFisher Scientific22561021
Penicillin-StreptomycinBioconcept4-01F00-H
10x RIPA bufferAbcamab156034
SigmaFast protease inhibitor tabletsSigma-AldrichS8820
96-well plates, sterile, flat-bottom, tissue culture treated CorningVWR29442-058
96-well plates, non-sterile, V-bottom CorningVWR29442-404used in the centrifugation step
96-well plate, conical bottom, NuncThermoFisher Scientific249944compatible with the Acquity UHPLC system
T75 cell culture flasks CorningSigma-AldrichCLS430641
Peelable heat sealing foilWaters186002789
Acquity UPLC systemWaters
Eppendorf Centrifuge 5810 RFisher Scientific05-413-323
Integration software: MassLynx V4.1WatersCatalog number not available
Combi thermo-sealer SP-0669/240WatersCatalog number not available
Quattro micro API Tandem Quadrupole SystemWatersCatalog number not available

参考文献

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