Gleichzeitige Messung von HDAC1 und HDAC6 Tätigkeit in HeLa-Zellen mit UHPLC-MS

Zusammenfassung

Das vorliegende Verfahren dient der Isoform-spezifische Inhibitoren der Histon Deacetylases (HDAC) in HeLa-Zellen durch die UHPLC-MS-Analyse von mehreren Substraten zu identifizieren. Dies ist ein Antikörper-freie Methode entwickelt, um HDAC1 und HDAC6 Tätigkeit im Wohnzimmer wiedergeben Zelle Umgebung, im Gegensatz zu Single-Isoform zellfreie Assays.

Zusammenfassung

Die Suche nach neuen Histon-Deacetylase (HDAC)-Inhibitoren ist zunehmend an Bedeutung in der Wirkstoffforschung. Isoform Selektivität ist die Genehmigung des Romidepsin, eine Klasse im Rampenlicht seit ich HDAC Inhibitor für Krebstherapie und die klinische Untersuchung der HDAC6-spezifische Hemmstoffe für Multiples Myelom. Das vorliegende Verfahren dient die inhibitorische Aktivität der Testverbindungen für HDAC1 und HDAC6 in den Zellen zu bestimmen. Die Isoform Aktivität wird anhand die ultra-high-Performance liquide Chromatography-Massenspektrometrie (UHPLC-MS) Analyse der spezifischen Substraten mit behandelten und unbehandelten HeLa-Zellen inkubiert. Die Methode hat den Vorteil der Reflexion der endogenen HDAC-Aktivität innerhalb der Umgebung der Zelle, im Gegensatz zur zellfreien biochemischen Assays auf isolierte Isoformen durchgeführt. Darüber hinaus da es auf die Quantifizierung der synthetische Substrate basiert, erfordert die Methode nicht die Antikörper Anerkennung der endogenen Schimmelpilzschäden Proteine. Es ist leicht anpassbar an verschiedene Zelllinien und einen automatisierten Prozess. Die Methode hat sich bereits bei der Suche nach HDAC6-selektive Verbindungen in Neuroblasten bewährt. Repräsentative Ergebnisse werden hier gezeigt, mit dem standard HDAC-Inhibitoren Trichostatin ein (unspezifisch), MS275 (HDAC1-spezifisch) und Tubastatin (HDAC6-spezifisch) mit HeLa-Zellen.

Einleitung

HDACs gehören zu einer Familie von Enzymen in der Lage, die Histone innerhalb der Chromatinstruktur deacetylate. Sie haben andere Protein-Substrate in der Zellflüssigkeit und befinden sich in verschiedenen Kompartimenten der Zelle. Insgesamt 18 HDAC-Isoformen wurden bisher identifiziert und haben wurde im Zusammenhang mit mehreren Zellmechanismen, einschließlich der Regulierung von Transkriptionsfaktoren und Genexpression sowie Zelle signalisieren und^{1,2,3,4,5,6,7}. Katalytische HDAC-Inhibitoren haben als mögliche therapeutische Medikamente für die Krebstherapie entwickelt. Die meisten HDAC-Inhibitoren derzeit von der FDA zugelassen sind für die Behandlung von T-Zell-Lymphom und Multiples Myelom, und unspezifische HDAC-Inhibitoren, wie z. B. Vorinostat (SAHA), Belinostat und Panobinostat^8,9. Jedoch eine Reihe von Nebenwirkungen wurden im Zusammenhang mit Pan-Hemmer, und die Suche nach Isoform-spezifische kleine Moleküle ist ein heißes Thema in der medizinischen Chemie und Drug Discovery. Entsprechend der Klasse ich (HDAC1-3 und HDAC8) selektiver Hemmstoff-Romidepsin ist ein bereits zugelassenes Medikament¹⁰, während HDAC6-spezifische Inhibitoren derzeit in klinischen Studien mit erhöhten therapeutisches Potenzial in multiplen Myeloms^{11,12,13,14,15}sind.

Screening-Tests zur Charakterisierung von HDAC Inhibitoren die Inkubation von einem HDAC-Substrat mit einer enzymatischen Quelle (einzelne Isoform, nukleare Extrakt oder Zelle lysate) basieren. Das Substrat ist in der Regel eine kleine Peptidsequenz eine Acetyl Lysin Rückstände mit einem spaltbaren Fluorophor (z. B. Cumarin), gekoppelt mit z. B. N-(4-methyl-7-aminocoumarinyl)-Nα-(t-butoxycarbonyl)-Nω-acetyllysineamide (MAL)¹⁶. Zur Unterscheidung zwischen Isoform-spezifische Aktivitäten separate zellfreie Assays unter Einbeziehung jedes Isoform notwendig sind und möglicherweise nicht wider die echte Isoform Aktivität in lebenden Zellen. Isoform-spezifische Substrate sind im Handel erhältlich, wie z. B. Benzyl (S)-[1-(4-methyl-2-oxo-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)-5-propionylaminopentyl]carbamate (MOCPAC, HDAC1 spezifische Substrat) und (S)-[5-acetylamino-1-(2-oxo-4-trifluoromethyl-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)pentyl]carbamic-Säure Tert-Butyl-Ester (BATCP, HDAC6 spezifische Substrat) (Abbildung 1 b). Allerdings wird ein Multi-Substrat-Gemisch mit MAL, MOCPAC und BATCP gegeben zu lebenden Zellen nicht die Erkennung der einzelnen deacetylated Produkte von fluorometrisch Messung erlauben angesichts der Tatsache, dass sie die gleichen spaltbaren Fluorophor tragen.

Die hier beschriebene Methode ermöglicht die Erkennung und relative Quantifizierung jedes Substrat und ihrer deacetylated Produkte in HeLa-Zellen mit einem Multi-Substrat-Assay, gefolgt von UHPLC-ESI-MS/MS-Analyse¹⁷. Ein HDAC-Test wird auf HeLa-Zellen ermöglichen die direkte Identifizierung von HDAC hemmende Aktivität und der Besonderheit des Testverbindungen auf endogene HDACs durchgeführt. Gibt es ein Fokus auf HDAC1 und HDAC6, die gleichzeitig ausgewertet werden. Um diese enzymatischen Messungen in einem einzigen Inkubation Assay zu erreichen, ist eine Mischung aus unspezifischen und spezifischen HDAC-Substrate behandelten und unbehandelten HeLa-Zellen auf eine 96-Well-Platte vergoldet hinzugefügt. Im Anschluss an eine Inkubationsschritt sind Zellen lysiert, veröffentlichte er die Substrate und ihre jeweiligen Reaktionsprodukte, die sind getrennt und mit einer UHPLC-MS-Methode (Abbildung 1) nachgewiesen. Die deacetylated Produkte der MAL, MOCPAC und BATCP Substrate sind die deacetylated MAL (dMAL), deacetylated MOCPAC (dMOCPAC) und deacetylated BATCP (dBATCP), beziehungsweise. Dosis-Wirkungs-Kurven können mit aktiven Verbindungen aufgebaut werden.

Abbildung 1: allgemeine Regelung für die zellbasierte HDAC-Assay, HDAC1 und HDAC6-spezifische Inhibitoren durch die UHPLC-MS-Analyse von mehreren Substraten zu identifizieren. (A) Schema eines typischen 96-Well-Platte mit behandelt (Testverbindungen) und unbehandelten (Kontrolle) HeLa-Zellen, sowie zellfreie Rohlinge. (B) chemische Struktur von Substraten durch endogene HDACs deacetylated als eine Mischung (21 µM) hinzugefügt. (C) typische UHPLC-MS Chromatogramm zeigt die Gipfeln die hinzugefügte Substrate (MAL, MOCPAC und BATCP) und ihre deacetylated Produkte (dMAL, dMOCPAC, und dBACTP, beziehungsweise). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Protokoll

(1) Zellkultur

Hinweis: Die folgenden Schritte sind in einem standard Gewebekultur Abzug durchgeführt. Vertrautheit mit steriler Technik wird erwartet.

1. Kultur von HeLa-Zellen zu 80 % Konfluenz in einem T75 Zelle Kultur Kolben in MEM ergänzt mit 10 % fötalen Rinderserum, Penicillin G (100 U/mL) und Streptomycin (100 mg/mL).
   Hinweis: Zelle Kultur, Behandlung und Lyse Schritte erfolgen unter Laminar-Flow mit Zelle Inkubation bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre des 5 % CO₂ unter sterilen Bedingungen durchgeführt.
2. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 5 mL des DPBS, aspirieren Sie des DPBS und fügen Sie 1 mL der Zelle Dissoziation Reagenz. Inkubation bei 37 ° C für 5 min um die Zellen zu lösen.
3. 9 mL Kulturmedium MEM hinzufügen, gründlich Aufschwemmen der Zellsuspension und zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer.
4. Passen Sie die Dichte der Zellsuspension auf 6 x 10⁴ Zellen/mL in MEM.
5. Fügen Sie 100 µL Zellsuspension Steuerelement hinzu und testen Sie die Brunnen von einem sterilen, flach-Boden, Gewebekultur behandelt 96-Well-Platte (Abbildung 1A).
6. Leere Brunnen von 96-Well-Platte (Abbildung 1A) 100 µL MEM Kulturmedium hinzufügen.
7. Inkubieren Sie die 96-Well-Platte bei 37 ° C für 24 h.
   Hinweis: Eine 24 h Inkubation ist eine passende Zeit für endogene HDAC-Aktivität in HeLa-Zellen zu testen. Verschiedene Zelltypen mit unbekannten HDAC-Aktivität können eine Timecourse Bewertung der Kontrollzellen benötigen.

2. Behandlung mit Testverbindungen und HDAC Substrate

1. Aspirieren Sie das Medium aus den Brunnen der 96-Well-Platte.
2. Hinzufügen von 25 µL 2 x Testverbindungen (z. B. Trichostatin A, MS275 und Tubastatin A) in MEM, Brunnen zu testen. Kontrolle und leeren Brunnen 25 µL MEM hinzufügen.
   Hinweis: Die Konzentration der Testverbindungen soll eingestellt werden, um eine Reihe von mindestens 5 Abschlusstest Konzentrationen (eine Konzentration pro Well) bieten. Die Endkonzentration von DMSO in der Testverbindung sollte sollte nicht mehr als 0,5 % und in jede Vertiefung, einschließlich Leerzeichen und Kontrollen. Die endgültige Inkubation beträgt 50 µL pro Bohrloch. Trichostatin A wird getestet, bei 5 Konzentrationen von 500 bis 1,95 nM (Verdünnung 1:4). MS275 und Tubastatin A sind bei 5 Konzentrationen von 8.000 bis hin zu 6.17 getestet nM (Verdünnung 1:6). Die gewünschte Abschlusstest Konzentration für jedes Testverbindung sollte von jedem einzelnen Benutzer bestimmt werden, durch die Schaffung einer Dosis-Wirkungs-Kurve.
3. Prüf- und Testanlagen Brunnen 25 µL der Substratmischung (42 µM MAL 42 µM MOCPAC und 42 µM BATCP in MEM) hinzufügen. Leere Brunnen 25 µL MEM hinzufügen.
   Hinweis: Die Endkonzentration von jedem Substrat ist 21 µM. MOCPAC und BATCP unterscheiden zwischen HDAC1 und HDAC6 Tätigkeit, bzw. (Abbildung 1 b). Wenn keine Aktivitäten mit diesen Substraten beobachtet wird, kann die Verwendung von MAL möglicherweise zur Identifizierung der Aktivität gegen eine weitere HDAC-Isoform führen.
4. Inkubieren Sie die 96-Well-Platte bei 37 ° C für 8 h in einer befeuchteten 5 % CO₂ Inkubator.
   Hinweis: Diese Inkubationszeit eignet sich für HeLa-Zellen und ermöglicht die endogenen HDAC zur Interaktion mit der synthetische Substrate. Verschiedenen Zelllinien erfordern Anpassungen im Inkubation Zeit und/oder Substrat Konzentration.

(3) Zell-Lyse und Probenvorbereitung für UHPLC-ESI-MS/MS

Achtung: Die Probe Vorbereitungsschritte verwenden organische Chemikalien, die leicht entzündlich und giftig durch Verschlucken oder einatmen. Geeignetsten persönlichen Schutzausrüstung wie Handschuhe und Schutzbrille zu tragen.

1. Fügen Sie 10 µL 6 X RIPA Puffer (aus 10 X RIPA-Puffer verdünnt) mit Protease-Inhibitor in jede Vertiefung der 96-Well-Platte ergänzt.
2. Stoppen der Reaktions durch Zugabe von 160 µL kalter Acetonitril in jede Vertiefung und Mischen von Pipettieren rauf und runter.
   Hinweis: Bewahren Sie die Acetonitril bei-20 ° C vor diesem Schritt.
3. Platzieren Sie die Platte in einer Gefriertruhe-80 ° C für 10 Minuten.
4. Entfernen Sie die Platte aus dem Gefrierschrank und übertragen Sie 220 µL des Inhalts der einzelnen Brunnen auf eine unsteril, konischen Boden (V-Boden) 96-Well-Platte. Zentrifugieren Sie die Platte bei 5.000 x g und 4 ° C für 10 min.
   Hinweis: Dieser Schritt zielt auf Proteine und Salze zu entfernen. Bei Bedarf können die Lösungen in einzelnen konischen Zentrifuge Rohre vor Zentrifugation übertragen oder gefiltert durch eine Reihe von 96-Well, 0,65 µm PVDF Filterplatten. Die Abwahl des Niederschlags ist vor der UHPLC-Analyse erforderlich.
5. 200 µL des Überstandes (oder Filtrat) in eine 96-Well-Platte mit dem UHPLC-System kompatibel und mit schweißtechnischen, abziehbare Folie mit einer Platte Versiegelung versiegeln.
   Hinweis: Vermeiden Sie die Pellets pipettieren, wenn Sie die Überstände entfernen. Wenn die UHPLC-Analyse sofort durchgeführt werden kann, kann die Platte bis zur Analyse bei 4 ° C für maximal 24 Stunden gespeichert.

4. UHPLC/MS-MS-Analyse

1. Bereiten Sie das UHPLC-System, indem es mit der mobilen Phase System (95 % A:5 % B):
   A: H₂O, HPLC-Klasse, mit 0,1 % Ameisensäure (bereiten Sie 1 L)
   B: Acetonitril, HPLC-Grade, mit 0,1 % Ameisensäure (bereiten Sie 1 L).
   Vorsicht: Die mobile Phase enthält organische Chemikalien, die leicht entzündlich und giftig durch Verschlucken oder einatmen. Geeignetsten persönlichen Schutzausrüstung wie Handschuhe und Schutzbrille zu tragen.
2. Platz 96-Well-Platte in der Beispiel-Manager enthält eine Kennzeichenhalter. Führen Sie die Proben nach Maßgabe UHPLC-ESI-MS/MS in Tabelle 1.
   Hinweis: Jede Spalte der analytischen 96-Well-Platte sollte auch eine Kontrolle und eine leere haben (wie dargestellt in das Platte-Schema der Abbildung 1A). Steuerelemente sind repräsentativ für 100 % enzymatische Aktivität in der getesteten Zell-Linie, während Rohlinge gibt es zu prüfen, ob die MS Quelle einheitlichen Hintergrund leistet. Ungewöhnliche MS Gipfeln in einem bestimmten Rohling erkannt sollte untersucht werden, um MS Empfindlichkeit Änderungen zu verhindern.

(5) Datenanalyse

1. Die Peakfläche jedes Substrat und ihrer deacetylated Produkte mit einem entsprechenden UHPLC-Integrations-Software zu integrieren.
   Hinweis: Verwenden Sie automatische Integration Parameter mit einem Glättungsverfahren (Mittelwert, Fenstergröße 3 und Anzahl von zum Beispiel 2, glatt). Mit den chromatographischen Bedingungen in Tabelle 1ist die Elution Reihenfolge dMAL (5,8 min), dBATCP (6,0 min), dMOCPAC (6,2 min), MAL (7,6 min), MOCPAC (8,9 min) und BATCP (9,8 min), wie in Abbildung 1dargestellt.
2. Berechnen Sie für jedes Substrat die Peak-Flächenverhältnis (deacetylated/acetyliert) in jedem Chromatogramm (Prüf-, Steuer- und Proben).
3. Berechnen Sie die prozentuale HDAC Hemmung von jeder Probe:
   
   Hinweis: HDAC1 Hemmung wird anhand der Peak-Flächenverhältnis von dMOCPAC/MOCPAC; HDAC6 Hemmung wird mit dBATCP/BATCP berechnet. Die Verhältnis dMAL/MAL kann verwendet werden, allgemeine HDAC Hemmung zum Ausdruck bringen.

Ergebnisse

Die Anwendung der Methode zur Identifizierung von nicht-selektiven und selektiver Inhibitoren für HDAC1 nachweisen (Klasse I) und HDAC6 (Klasse IIb), HeLa-Zellen wurden mit bekannten standard-Compounds behandelt: Trichostatin A (nicht-selektiven zwischen HDAC1 und HDAC6)¹⁸, MS275 (HDAC1-selektiver Hemmstoff)¹⁹und Tubastatin (HDAC6-selektiver Hemmstoff)²⁰. Mithilfe der vorliegenden Methode (Abbild...

Diskussion

HDAC-Hemmung ist ein heißes Thema in der Drogeentdeckung, mit dem aktuellen Fokus auf HDAC6-selektive Inhibitoren für Krebs-Therapie-²¹. HDAC Selektivität bemisst sich in der Regel durch eine Reihe von hohem Durchsatz, zellfreie Assays, die beabsichtigen, die inhibitorische Potenz gegenüber einzelnen HDAC Isoformen²¹bestimmen. Jedoch die Selektivität der Inhibitor muss zusätzlich bestätigt werden in lebenden Zellen durch die Auswertung des Acetylierung Status des end...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
BATCP	Sigma-Aldrich	B4061
MAL	Sigma-Aldrich	SCP0168	Synonym: BOC-Ac-Lys-AMC
MOCPAC	Sigma-Aldrich	M2195
MS275	Sigma-Aldrich	EPS002
Trichostatin A	Sigma-Aldrich	T8552
Tubastatin A	Sigma-Aldrich	SML0044
Acetonitrile, HPLC grade	Fisher Scientific	10660131
Formic acid, LC/MS grade	Fisher Scientific	10596814
H2O, HPLC grade			distilled H2O filtered through a Milli-Q purification system
HeLa cells	ATCC	ATCC CRM-CCL-2
Cell dissociation reagent TrypLE Express	ThermoFisher Scientific	12604013
DMSO, cell culture grade	Applichem	146463
DPBS	ThermoFisher Scientific	14190144
Fetal bovine serum	Biowest	S1810
MEM	ThermoFisher Scientific	22561021
Penicillin-Streptomycin	Bioconcept	4-01F00-H
10X RIPA buffer	Abcam	ab156034
SigmaFast protease inhibitor tablets	Sigma-Aldrich	S8820
96-well plates, sterile, flat-bottom, tissue culture treated Corning	VWR	29442-058
96-well plates, non-sterile, V-bottom Corning	VWR	29442-404	used in the centrifugation step
96-well plate, conical bottom, Nunc	ThermoFisher Scientific	249944	compatible with the Acquity UHPLC system
T75  cell culture flasks Corning	Sigma-Aldrich	CLS430641
Peelable heat sealing foil	Waters	186002789
Acquity UPLC system	Waters
Eppendorf Centrifuge 5810 R	Fisher Scientific	05-413-323
Integration software: MassLynx V4.1	Waters		Catalog number not available
Combi thermo-sealer SP-0669/240	Waters		Catalog number not available
Quattro micro API Tandem Quadrupole System	Waters		Catalog number not available