Misura simultanea di HDAC1 e HDAC6 attività in HeLa Cells utilizzando UHPLC-MS

Riepilogo

Il presente metodo serve a identificare isoforma-specifici inibitori dell'istone deacetilasi (HDAC) in cellule HeLa dall'analisi UHPLC-MS di substrati multipli. Questo è un metodo privo di anticorpi sviluppato per riflettere l'attività HDAC1 e HDAC6 del vita ambiente cellulare, in contrasto con le analisi senza cellula singola isoforma.

Abstract

La ricerca di nuovi inibitori delle istone deacetilasi (HDAC) è di crescente interesse nella scoperta della droga. Isoforma selettività è stato sotto i riflettori dopo l'approvazione del romidepsina, una classe ho HDAC inibitore per la terapia del cancro e l'indagine clinica degli inibitori HDAC6-specifico per il mieloma multiplo. Il presente metodo è utilizzato per determinare l'attività inibitoria di sostanze da testare su HDAC1 e HDAC6 nelle cellule. L'attività dell'isoforma è misurata usando la cromatografia liquida ultra-high-performance – analisi di spettrometria di massa (UHPLC-MS) di specifici substrati incubati con cellule HeLa trattate e non trattate. Il metodo ha il vantaggio di riflettere l'attività HDAC endogena all'interno dell'ambiente di cella, in contrasto con analisi senza cellula biochimiche condotte su isoforme isolato. Inoltre, perché si basa sulla quantificazione dei substrati sintetici, il metodo non richiede il riconoscimento anticorpale di proteine endogene acetilati. È facilmente adattabile a diverse linee cellulari e un processo automatizzato. Il metodo ha già dimostrato utile nella ricerca di composti HDAC6-selettiva in neuroblasti. Risultati rappresentativi sono indicati qui con standard HDAC inibitori tricostatina A (non-specifico), MS275 (HDAC1-specifica), e tubastatin un (HDAC6-specifico) utilizzando cellule HeLa.

Introduzione

HDAC appartengono ad una famiglia di enzimi in grado di deacetilano gli istoni all'interno della struttura della cromatina. Hanno anche altri substrati della proteina nel citosol e si trovano in vari compartimenti cellulari. Un totale di 18 HDAC isoforme sono state identificate finora e sono stati collegati con parecchi meccanismi delle cellule, compreso la regolazione di fattori di trascrizione e l'espressione genica, come pure la segnalazione delle cellule e trasporto^{1,2,3,4,5,6,7}. Inibitori HDAC catalitici sono emersi come terapeutici potenziali farmaci per la terapia del cancro. La maggior parte delle HDAC inibitori attualmente approvati dalla FDA sono per il trattamento di linfoma a cellula T ed il mieloma multiplo e sono inibitori HDAC aspecifici come vorinostat (SAHA), belinostat e panobinostat^8,9. Tuttavia, una serie di effetti collaterali sono stati associati con gli inibitori di pan, e la ricerca di piccole molecole isoforma-specifici è un tema caldo nella scoperta di droga e chimica medicinale. Di conseguenza, la classe ho romidepsina inibitore selettivo (HDAC1-3 e HDAC8) è un farmaco già approvato¹⁰, mentre gli inibitori HDAC6-specific sono attualmente oggetto di studi clinici, con maggiore potenziale terapeutico in mieloma multiplo^{11,12,13,14,15}.

Lo screening di saggi per caratterizzare HDAC inibitori sono basati sull'incubazione di un substrato HDAC con un'origine enzimatica (singola isoforma, estratto nucleare o lysate delle cellule). Il substrato è solitamente una sequenza del peptide di piccole dimensioni contenente un residuo di lisina acetil accoppiato ad un fluoroforo spaccabili (ad es., cumarina), ad esempio N-(4-methyl-7-aminocoumarinyl)-Nα-(t-butoxycarbonyl)-Nω-acetyllysineamide (MAL)¹⁶. Per distinguere tra attività isoforma-specifici, analisi senza cellula separate che coinvolgono ciascuna isoforma sono necessari e potrebbero non riflettere l'attività dell'isoforma reale in cellule viventi. Isoforma-specifici substrati sono commercialmente disponibili, come benzilico (S)-[1-(4-methyl-2-oxo-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)-5-propionylaminopentyl]carbamate (MOCPAC, HDAC1 specifico substrato) e (S)-[5-acetylamino-1-(2-oxo-4-trifluoromethyl-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)pentyl]carbamic acid tert-butile (BATCP, HDAC6 substrato specifico) (Figura 1B). Tuttavia, una miscela di multi-substrata contenente MAL, MOCPAC e BATCP dato alle cellule viventi non permetterà la rilevazione dei singoli prodotti deacetylated da fluorometrica misurazione, dato che essi portano il fluoroforo spaccabili stesso.

Il metodo qui descritto consente la rilevazione e quantificazione relativa di ogni substrato ed il suo prodotto deacetylated in cellule HeLa usando un'analisi multi-substrata seguita da UHPLC-ESI-MS/MS analisi¹⁷. Un'analisi HDAC è condotto su cellule HeLa per consentire l'identificazione diretta di attivita ' inibitoria e della specificità della prova composti endogeni HDACs. C'è un focus su HDAC1 e HDAC6, che vengono valutati contemporaneamente. Per ottenere queste misurazioni enzimatiche in un'analisi di incubazione singola, una miscela di substrati HDAC aspecifici e specifici è aggiunto ai trattati e non trattate cellule HeLa placcate su una piastra a 96 pozzetti. A seguito di una fase di incubazione, le cellule vengono lisate per rilasciare i substrati ed i loro prodotti di reazione rispettiva, che sono separati e rilevato usando un metodo UHPLC-MS (Figura 1). I prodotti deacetylated dei substrati MAL, MOCPAC e BATCP sono il MAL deacetylated (dMAL), deacetylated MOCPAC (dMOCPAC) e deacetylated BATCP (dBATCP), rispettivamente. Curve dose-risposta possono essere costruite con composti attivi.

Figura 1: schema generale per il saggio HDAC basati su celle a identificare gli inibitori specifici HDAC1 e HDAC6 dall'analisi dei substrati multipli UHPLC-MS. (A) schema di una tipica piastra a 96 pozzetti contenenti trattati (test composti) e cellule HeLa non trattati (controllo), nonché spazi vuoti senza cellula. (B) struttura chimica dei substrati aggiunti come una miscela (21 µM ciascuna) per essere viene desacetilato agli acidi di HDACs endogeno. (C) UHPLC-MS tipico cromatogramma mostrando le cime dei substrati aggiunto (MAL, MOCPAC e BATCP) e loro prodotti deacetylated (dMAL, dMOCPAC e dBACTP, rispettivamente). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocollo

1. coltura cellulare

Nota: I seguenti passaggi vengono eseguiti in una cappa di coltura di tessuti standard. Familiarità con tecnica sterile è previsto.

1. Coltura di cellule HeLa al confluency di 80% in un matraccio di cultura cellulare T75 in MEM completati con 10% siero bovino fetale, penicillina G (100 U/mL) e la streptomicina (100 mg/mL).
   Nota: Cultura, il trattamento e passaggi di lisi delle cellule sono condotti sotto flusso laminare, con fasi di incubazione delle cellule a 37 ° C, eseguite in atmosfera umidificata di 5% CO₂ in condizioni sterili.
2. Lavare le cellule due volte con 5 mL di DPBS, aspirare il DPBS e aggiungere 1 mL di reagente di dissociazione delle cellule. Incubare a 37 ° C per 5 min staccare le cellule.
3. Aggiungere 9 mL di terreno di coltura MEM, accuratamente Risospendere la sospensione cellulare e contare le celle utilizzando un emocitometro.
4. Regolare la densità della sospensione delle cellule a 6 x 10⁴ cellule/mL in MEM.
5. Aggiungere 100 µ l di sospensione cellulare di controllo e test dei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti sterile, fondo piatto, coltura del tessuto-trattati (Figura 1A).
6. Aggiungere 100 µ l di terreno di coltura MEM a vuoti pozzetti della piastra 96 pozzetti (Figura 1A).
7. Incubare la piastra a 96 pozzetti a 37 ° C per 24 h.
   Nota: Un'incubazione di 24 ore è un tempo adatto per verificare l'attività endogena di HDAC in cellule HeLa. Diversi tipi di cellule con attività di HDAC sconosciuto potrebbero essere necessario una valutazione timecourse delle cellule di controllo.

2. cell trattamento con sostanze da testare e substrati HDAC

1. Aspirare il mezzo dai pozzetti della piastra 96 pozzetti.
2. Aggiungere 25 µ l di sostanze da testare: 2x (ad es., tricostatina A, MS275 e tubastatin A) in MEM di pozzi di prova. Aggiungere 25 µ l di MEM per controllo e pozzetti del bianco.
   Nota: La concentrazione delle sostanze da testare è quello di essere regolato per fornire un intervallo di almeno 5 concentrazioni di prova finale (una concentrazione per pozzetto). La concentrazione finale di DMSO nel composto in esame non dovrebbe superare lo 0,5% e dovrebbe essere la stessa in ciascun pozzetto, compresi spazi vuoti e i controlli. Il volume di incubazione finale è di 50 µ l per pozzetto. Trichostatin A è stato testato in 5 concentrazioni che variano da 500 a 1,95 nM (diluizione 1:4). MS275 e tubastatin A sono testati a 5 concentrazioni che variano da 8.000 a 6,17 nM (diluizione 1:6). La concentrazione di prova finale desiderata per ogni sostanza in esame dovrebbe essere determinata da ogni singolo utente creando una curva dose-risposta.
3. Aggiungere 25 µ l della miscela substrato (42 µM di MAL, 42 µM di MOCPAC e 42 µM di BATCP in MEM) nei pozzetti di controllo e prova. Aggiungere 25 µ l di MEM per pozzetti del bianco.
   Nota: La concentrazione finale di ogni substrato è 21 µM. MOCPAC e BATCP distinguere tra attività HDAC1 e HDAC6, rispettivamente (Figura 1B). Quando nessuna attività è osservata con quei substrati, l'uso di MAL potenzialmente potrebbe portare all'identificazione di attività contro un'altra isoforma HDAC.
4. Incubare la piastra a 96 pozzetti a 37 ° C per 8 h in un 5% umidificata incubatore a CO₂ .
   Nota: Questo tempo di incubazione è adatto per le cellule HeLa e permette le HDAC endogena di interagire con i substrati sintetici. Diverse linee cellulari possono richiedere adattamenti nella concentrazione di substrato e/o di tempo di incubazione.

3. cellula Lisi e preparazione del campione per UHPLC-ESI-MS/MS

Attenzione: La procedura di preparazione del campione utilizza prodotti chimici organici, che sono altamente infiammabile e tossico per ingestione o inalazione. Indossare adeguata protezione personale, come guanti e occhiali di sicurezza.

1. Aggiungere 10 µ l di buffer di x RIPA 6 (diluito da 10 x RIPA buffer) completati con inibitore della proteasi in ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti.
2. Bloccare la reazione aggiungendo 160 µ l di acetonitrile freddo in ciascun pozzetto e Miscelare pipettando su e giù.
   Nota: Tenere l'acetonitrile a-20 ° C prima di questo passaggio.
3. Posizionare la piastra in un congelatore-80 ° C per 10 min.
4. Rimuovere il piatto dal freezer e trasferire 220 µ l del contenuto di ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti non sterili, fondo conico (fondo V). Centrifugare la piastra a 5.000 x g e a 4 ° C per 10 min.
   Nota: Questo passaggio mira a rimuovere le proteine e sali. Se necessario, le soluzioni possono essere trasferite ai tubi singoli conica per centrifuga prima della centrifugazione o filtrate attraverso una serie di 96 pozzetti, piastre filtranti di 0,65 µm PVDF. La rimozione di successo del precipitato è richiesta prima dell'analisi UHPLC.
5. Trasferire 200 µ l di supernatante (o filtrato) in una piastra a 96 pozzetti compatibile con il sistema UHPLC e sigillare con un foglio pelabile, termosaldatura, utilizzando un foglio sigillante.
   Nota: Evitare di pipettaggio il pellet quando si rimuove i sovranatante. Se l'analisi UHPLC non può essere eseguita immediatamente, la piastra possa essere memorizzata a 4 ° C per un massimo di 24 h fino all'analisi.

4. UHPLC/MS-MS Analysis

1. Preparare il sistema UHPLC riempiendolo con il sistema della fase mobile (95% A:5% B):
   R: H₂O, HPLC-grado, contenente acido formico 0.1% (preparare 1 L)
   B: Acetonitrile, HPLC-grado, contenente acido formico 0.1% (preparare 1L).
   Attenzione: La fase mobile contiene prodotti chimici organici, che sono altamente infiammabile e tossico per ingestione o inalazione. Indossare adeguata protezione personale, come guanti e occhiali di sicurezza.
2. La gestione di esempio contenente un portatarga, inserire la piastra a 96 pozzetti. Eseguire i campioni secondo le condizioni di UHPLC-ESI-MS/MS indicati nella tabella 1.
   Nota: Ogni colonna della piastra 96 pozzetti analitica dovrebbe avere un controllo del bene ed un pozzetto vuoto (come raffigurato nello schema di Figura 1Apiastra). I controlli sono rappresentante del 100% di attività enzimatica nella linea cellulare testata, mentre gli spazii in bianco sono lì per verificare se l'origine di MS stia fornendo sfondo coerenza. Insolito MS picchi rilevati in un determinato campo vuoto dovrebbero essere studiati per impedire i cambiamenti di sensibilità di MS.

5. analisi dei dati

1. Integrare l'area del picco di ogni substrato ed il suo prodotto deacetylated con un software di integrazione UHPLC appropriato.
   Nota: Utilizzare i parametri di integrazione automatica con un metodo smoothing (media, dimensione della finestra 3 e numero di liscio 2, ad esempio). Utilizzando le condizioni cromatografiche indicate nella tabella 1, l'ordine di eluizione è dMAL (5,8 min), dBATCP (6,0 min), dMOCPAC (6,2 min), MAL (7,6 min), MOCPAC (8,9 min) e BATCP (9,8 min), come illustrato nella Figura 1.
2. Per ogni substrato, calcolare il rapporto tra area di picco (viene desacetilato agli acidi/acetilato) in ogni cromatogramma (campioni di controllo e test).
3. Calcolare l'inibizione di HDAC percentuale di ciascun campione da testare:
   
   Nota: HDAC1 inibizione viene calcolata utilizzando il rapporto tra area di picco di dMOCPAC/MOCPAC; HDAC6 inibizione viene calcolata con dBATCP/BATCP. Il rapporto dMAL/MAL può essere utilizzato per esprimere generale inibizione di HDAC.

Risultati

Per illustrare l'applicazione del metodo all'identificazione di inibitori selettivi e non selettivi per HDAC1 (classe I) e HDAC6 (classe IIb), le cellule HeLa sono state trattate con composti standard conosciuti: tricostatina A (non-selettivi tra HDAC1 e HDAC6)¹⁸, MS275 (HDAC1-selettivo inibitore)¹⁹e tubastatin (HDAC6-selettivo inibitore)²⁰. Utilizzando il presente metodo (Figura 1), valo...

Discussione

Inibizione di HDAC è un tema caldo nella scoperta della droga, con un focus corrente su HDAC6-selettivi per cancro terapia²¹. Selettività HDAC solitamente è valutata da una serie di saggi di alto-rendimento, senza cellula, che intende determinare la potenza inibitoria verso singoli HDAC isoforme²¹. Tuttavia, la selettività di un inibitore deve essere ulteriormente confermata in cellule viventi valutando lo stato di acetilazione di substrati di proteine endogene, quali g...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
BATCP	Sigma-Aldrich	B4061
MAL	Sigma-Aldrich	SCP0168	Synonym: BOC-Ac-Lys-AMC
MOCPAC	Sigma-Aldrich	M2195
MS275	Sigma-Aldrich	EPS002
Trichostatin A	Sigma-Aldrich	T8552
Tubastatin A	Sigma-Aldrich	SML0044
Acetonitrile, HPLC grade	Fisher Scientific	10660131
Formic acid, LC/MS grade	Fisher Scientific	10596814
H2O, HPLC grade			distilled H2O filtered through a Milli-Q purification system
HeLa cells	ATCC	ATCC CRM-CCL-2
Cell dissociation reagent TrypLE Express	ThermoFisher Scientific	12604013
DMSO, cell culture grade	Applichem	146463
DPBS	ThermoFisher Scientific	14190144
Fetal bovine serum	Biowest	S1810
MEM	ThermoFisher Scientific	22561021
Penicillin-Streptomycin	Bioconcept	4-01F00-H
10X RIPA buffer	Abcam	ab156034
SigmaFast protease inhibitor tablets	Sigma-Aldrich	S8820
96-well plates, sterile, flat-bottom, tissue culture treated Corning	VWR	29442-058
96-well plates, non-sterile, V-bottom Corning	VWR	29442-404	used in the centrifugation step
96-well plate, conical bottom, Nunc	ThermoFisher Scientific	249944	compatible with the Acquity UHPLC system
T75  cell culture flasks Corning	Sigma-Aldrich	CLS430641
Peelable heat sealing foil	Waters	186002789
Acquity UPLC system	Waters
Eppendorf Centrifuge 5810 R	Fisher Scientific	05-413-323
Integration software: MassLynx V4.1	Waters		Catalog number not available
Combi thermo-sealer SP-0669/240	Waters		Catalog number not available
Quattro micro API Tandem Quadrupole System	Waters		Catalog number not available