用肽微阵列分析组蛋白抗体特异性

摘要

该手稿描述了将肽微阵列技术应用于识别组蛋白及其翻译后修饰的抗体的特异性分析的方法。

摘要

组蛋白蛋白的翻译后修饰（PTM）在调节染色质结构和基因表达方面的作用被广泛研究。组蛋白PTM特异性抗体的大规模生产和分布大大促进了对这些标记的研究。由于组蛋白PTM抗体是许多染色质生物化学应用的关键试剂，因此严格的抗体特异性分析对准确的数据解释和现场持续进展是必需的。该协议描述了用于分析组蛋白抗体特异性的肽微阵列的设计，制造和使用的集成管线。该方案的设计和分析方面由ArrayNinja（一种我们最近开发的开源和交互式软件包）来简化微阵列打印格式的定制。该管道已被用于筛选大量市售和广泛使用的组蛋白PTM抗体s，并且通过在线和扩展的组蛋白抗体特异性数据库免费获得从这些实验产生的数据。除组蛋白之外，本文描述的一般方法可广泛应用于PTM特异性抗体的分析。

引言

基因组DNA通过组蛋白蛋白质优雅地包装在真核细胞核内，形成染色质。染色质的重复亚基是核小体，它由围绕组蛋白的八聚体核心卷绕DNA的147个碱基对- H2A，H2B，H3和H4 ^1。染色质广泛地组织成松散包装的真空染色质和紧密堆积的异染色质结构域。染色质紧密程度调节了蛋白质机制能够访问底层DNA进行基本DNA模板过程（如复制，转录和修复）的程度。

在染色质的上下文中的基因组可访问的关键调节剂是对组蛋白^2，3的非结构化尾和核心结构域翻译后修饰。组蛋白PTMs通过影响染色质⁴的结构并间接作用直接起作用h招聘读者蛋白质及其相关的大分子复合物，其具有染色质重塑，酶促和脚手架活动⁵ 。组蛋白PTM功能在过去二十年的研究绝大多数都表明这些标记在调节细胞命运，生物体发育和疾病发生/进展中起关键作用。由于基于质谱的蛋白质组学技术的进步，已发现超过20种独特的组蛋白PTM超过80种不同的组蛋白残基⁶ 。值得注意的是，这些修改往往发生在组合，并与"组蛋白密码"假设是一致的，大量的研究表明，读者蛋白质通过识别组蛋白PTM的^7，8，9的特定组合的有针对性的染色质的离散区域。向前迈进的一个关键挑战将是将功能分配给gr组蛋白PTM的不完整列表，并确定组蛋白PTM的具体组合如何协调与染色质相关的动态功能。

抗体是用于检测组蛋白PTM的lynchpin试剂。因此，已经商业开发了用于染色质生物化学研究的超过1,000种组蛋白PTM特异性抗体。随着高通量DNA测序技术的快速发展，这些试剂被ChIP-seq（染色质免疫沉淀加上下一代测序）的个别研究者和大规模表观遗传学"路线图"计划（ 例如 ENCODE和BLUEPRINT）广泛使用）等的管道以产生组蛋白PTM分发的全基因组^10，11的高分辨率空间地图。然而，最近的研究已经表明，组蛋白PTM抗体的特异性可能是高度可变的，并且这些试剂显示不合适 avorable性能如脱靶表位识别，由相邻的PTM强阳性和负面影响，以及难以在特定残基鉴别修饰顺序（ 例如 ，单- ，二- ，或三甲基赖氨酸^{）12，13，14，15 ，16，17，18。}因此，组蛋白PTM特异性抗体试剂的严格质量控制对于准确解释用这些有价值的试剂产生的数据是必要的。

微阵列技术能够以高通量，可重现和小型化的格式同时询问成千上万的大分子相互作用。为此，已经创建了各种微阵列平台来分析蛋白质-DNA ^{19 ，}"> 20，蛋白质^21，和蛋白质-肽相互作用^22。事实上，组蛋白肽微阵列已经成为一个信息发现平台染色质生物化学研究，使作家，橡皮擦的高通量分析，和翻译后修饰¹⁵组蛋白的读者^{，23，24，}以及用于组蛋白抗体特异性的分析^17，25。除了其在染色质和表观遗传学研究中的应用，组蛋白肽阵列具有潜在效用作为诊断/预后测试系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病，其中抗染色质自身抗体产生^26,27。

在这里，我们描述了我们为设计，制造和排队开发的集成管道使组蛋白肽微阵列产生识别组蛋白及其PTMs的抗体的特异性谱。我们最近开发的ArrayNinja是一个开源的交互式软件应用程序，其中集成了微阵列实验的设计和分析阶段²⁸ 。 ArrayNinja在Google Chrome中效果最好。简言之，机器人接触式微阵列打印机用于在链霉亲和素包被的玻璃显微镜载片上的限定位置沉积生物素 - 缀合的组蛋白文库。然后可以以竞争性和平行的测定形式使用数组来询问抗体 - 表位相互作用（ 图1 ）。肽文库由数百种独特的合成肽组成，分别含有PTM（赖氨酸乙酰化，赖氨酸/精氨酸甲基化和丝氨酸/苏氨酸磷酸化），以及大部分衍生自蛋白质组学数据集的相关组合。肽合成和验证方法在其他地方详细²³ 。使用该阵列平台从我们正在进行的组蛋白PTM抗体筛选工作产生的数据归档在公共网络资源 - 组蛋白抗体特异性数据库（www.histoneantibodies.com）上。值得注意的是，与此协议的变型制造的组蛋白肽的微阵列也已被广泛地用于表征组蛋白PTM读者域^{8，29，30，31，32，33，34，35，36，37}的活性以及最近个人资料组蛋白PTM作家和橡皮擦活动²⁴ 。

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图1:组蛋白肽微阵列上抗体筛选的逐步程序的动画描述。具有确定的翻译后修饰（红色和蓝色圆圈）的生物素化组蛋白肽与生物素荧光素在链霉抗生物素蛋白包被的玻璃上共同印刷。正相互作用可视化为红色荧光。 请点击此处查看此图的较大版本。

研究方案

1.安装并运行ArrayNinja

1. 从www.virtualbox.org下载并安装Oracle Virtual Box。
2. 从http://research.vai.org/Tools/arrayninja下载并解压缩ArrayNinja虚拟机（VM）。
3. 打开虚拟框，并通过单击"机器"，"添加"添加ArrayNinja VM，然后从保存了ArrayNinja VM的文件夹中选择arrayninja.vbox。
4. 通过在Virtual Box中选择它并点击绿色的"开始"箭头启动ArrayNinja。
5. 虚拟框将打开一个新窗口，并显示一条消息，通过将Web浏览器导航到localhost可以访问VM:2080。60;注意:ArrayNinja的集装式版本也可通过 hub.docker.com/r/bradley.dickson/arrayninja/获取

2.设计阵列幻灯片和源板布局

1. 在ArrayNinja界面的"计划幻灯片布局"标题下，单击与正在使用的微阵列打印机对应的链接。
   注意:ArrayNinja已被编程为模拟两种常用微阵列打印机的机器人运动（ 见表1）。可以根据要求配置与其他阵列的兼容性。
2. 单击"加载板"对话框中的"空"，然后单击"输入"。有关ArrayNinja设计模块的屏幕截图，请参见图2 。
3. 调整光斑直径为275μm，光斑间距为375μm。调整剩余的设置（板块/板排，总板排，复制，y中的特征，超级阵列，SuperA软糖;参见图2 ），以自定义功能如何在微阵列幻灯片上显示。
   注意:光斑直径取决于微阵列针脚的大小。随着这些设置的调整，卡通幻灯片将实时更新。使用此卡通来预览每个设置如何修改最终的幻灯片布局。
4. 在幻灯片上的功能布局完成后，将鼠标悬停在每个唯一功能上，并在弹出的对话框中输入功能标识符。
   注意:功能标识符可以由数字，字母或组合组成。这仅适用于唯一功能，当选择复制时，不会显示对话框。
5. 在所有唯一功能分配了一个标识符之后，点击"填充"。输入幻灯片布局的名称，然后点击"打印您的盘子"保存。将打开一个新页面，显示制作所选滑块设计所需的384孔源板数，以及映射要加载在源板中的每个要素的物理位置的表格。
   注意:记住此名称，因为它将用于在分析微阵列数据时调用此设计（参见第6.2节）。点击"打印你的盘子"将布局保存在ArrayNinja中。

图2:ArrayNinja设计模块。的屏幕截图 ArrayNinja设计模块以虚线显示。控制面板（上图）显示了可在微阵列打印机上更改的所有参数。随着这些参数的调整，幻灯片布局（左下角）的卡通图像实时更新。设置布局后，用户可以将鼠标悬停在各个点上，以输入唯一的功能标识符。来自该用户的ArrayNinja结构输入制作指定微阵列幻灯片布局所需的源平板（右下）中每个要素的位置的映射。 请点击此处查看此图的较大版本。

3.制造微阵列

1. 准备源板
   1. 使用第2.5节中使用ArrayNinja生成的地图创建384孔源板。
      注意:在这个平台上查询的肽的详细描述可以在别处找到s ="xref"> 17。
   2. 将每个特征（ 例如 ，生物素化的组蛋白肽）1-2μL沉积到384孔源板的正确孔中。
      注意:生物素化的组蛋白肽通常从200-400μM储备溶液中沉积，这等于在单个阵列斑点中10至25倍摩尔过量的肽与链霉亲和素结合位点。这是使用以下公式计算的:
      
      其中V是由销引起的体积，[ P ]是要打印的特征的浓度， N _A是Avogadro的数量， S是点的表面积。 C是载玻片的覆盖率，表示为每单位面积的链霉亲和素分子数乘以3（可用的链霉亲和素结合位点的平均数）。 V和C由相应的制造商获得。其他功能可能需要不同的浓度，这取决于生物分子的大小，其中拥挤可能是一个问题。应经验测试每种新型特征的一系列印刷浓度，以确定最佳印刷浓度。
   3. 将每个特征稀释10倍，并加入补充有1％牛血清白蛋白（BSA）的1x印刷缓冲液。在室温下将源极板以500×g旋转2分钟。
      注意:推荐在印刷缓冲液中加入荧光素标记的生物素（5μg/μL）作为斑点控制，并作为视觉辅助，以便于分析过程中正确的阵列对准（ 见图4 ）。
2. 打印协议（ 图3A -B ）。
   1. 通过清空废物收集容器并用无菌蒸馏水填充洗涤液容器和加湿器容器来准备排液器。
   2. 输入参数used将ArrayNinja（第2节和图2 ）中的幻灯片设计到微阵列打印机控制程序中。
   3. 使用微阵列打印机控制程序，设置1次洗涤的洗涤步骤。设置后清洗设置，每次清洗后重新浸渍5次。将湿度设置为60％。
      注意:最佳洗涤配置可能因使用的微阵列打印机而异。根据所使用的微阵列打印机，最佳的洗后针浸渍配置可以变化。
   4. 将功能化的载玻片（ 例如 ，链霉抗生物素蛋白包被的玻璃）插入基板压板，并将所有的压板放入压板升降机。将源板插入板架，并放入源板升降机。
   5. 点击"打印"。监控打印过程中的几轮特征沉积，以确保所有的洗涤和浸渍设置是正确的。打印运行完成后，删除衬底从阵列器压出。
      注意:当大的打印运行禁止在一天内完成阻塞步骤时，印刷的幻灯片可以在4℃的加湿室中孵育过夜。将玻璃杯旁边的一个小烧杯放在用塑料包装密封的纸板箱内。
   6. 在室温下用封闭缓冲液封闭载玻片30分钟混合。
   7. 在室温下用磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH 7.6混合洗涤载玻片2×10分钟。通过在微阵列载玻片离心机中在室温下旋转30秒来干燥载玻片。
      注意:为了一次处理大量的载玻片，可以使用高通量显微镜载玻片清洗室，以便平行洗涤50个载玻片。
   8. 对于设计为用蜡分隔的滑块，请参见4.1节。对于所有其他设计，请在4°C下保存不受光照和潮湿的幻灯片。
      注:印刷生物素化组蛋白肽以这种方式存储至少6个月是稳定的。

4.分割微阵列幻灯片

1. 疏水蜡笔（ 图3C ）
   1. 使用蜡笔在包含特征的区域上涂蜡。让蜡在空气中干燥5分钟，然后再进入第5部分。
      注意:阻塞后，阵列斑点可能很难通过眼睛可视化。来自ArrayNinja的幻灯片设计可以打印成比例尺，并用作涂蜡的指南。
2. 硅垫片（ 图3D ）
   1. 将透明膜从阵列垫片的背面剥离，并将粘合剂侧面放在微阵列载片上。
   2. 在进入第5部分之前，将垫圈固定到位。
3. 蜡印记（ 图3E ）
   1. 对于设计为用蜡分隔的载玻片，使用10％BSA在普通玻璃上打印测试载玻片。使用此测试滑块优化蜡打印机导轨或阵列设置，以确保所有功能都将在蜡模腔内。
   2. 将微阵列蜡打磨机加热至85°C，直到所有蜡完全熔化，约30分钟。
   3. 将打印面朝下插入幻灯片，将幻灯片一直推到微阵列打印机上的右侧导板上。拉动杠杆使模具与滑块的表面接触。持续2秒。
      注意:可以更改保持时间以达到最佳蜡边界厚度。
   4. 快速移除幻灯片，目视检查蜡边界，确保所有的井都被封闭，并且边界不那么厚，以致它们侵入斑点。在4°C保存幻灯片，防止潮湿和光线。
      注意:可以增加或减少保持时间以获得更厚或更薄的边界。

图3:微阵列制造。 （A）使用接触式微阵列打印机的链霉抗生物素蛋白包被的显微镜载玻片上的组蛋白肽微阵列制备。 （B）使用48×48格肽肽特征的3个子阵列制造的微阵列。 （C） 3个亚基与疏水性蜡笔的分离， （D） 2个硅胶粘合剂的子阵列和（E）具有蜡印痕的48个子阵列。所示的所有微阵列使用25×75mm显微镜载玻片制造。 请点击此处查看此图的较大版本。

5.将组蛋白PTM抗体与肽微阵列杂交

1. 准备杂交缓冲液（PBS，pH 7.6,5％BSA，0.1％Tween-20）。
2. 在载玻片杂交缓冲液中平衡使用杂交容器。在杂交缓冲液中完全覆盖整个载玻片，并在低速下在轨道振荡器上在4℃下孵育30分钟。
3. 在杂交缓冲液中制备含有稀释的组蛋白PTM抗体的溶液。
   注意:在实施例数据中，组蛋白抗体＃1和抗体＃2在杂交缓冲液中以1:1000稀释。推荐与免疫印迹相似的稀释范围作为起点。
4. 在4℃下用抗体溶液孵育阵列1小时。去除抗体溶液，并在4℃用冷PBS，pH 7.6洗涤阵列3次，5分钟。
5. 在杂交缓冲液中制备1:5,000 - 1:10,000稀释荧光染料缀合的二抗。
6. 在4℃下用二抗溶液孵育阵列30分钟，防止光照。取出二次抗体溶液，并在4℃用PBS，pH 7.6洗涤微阵列载玻片3次5分钟。蘸将微阵列置于含有0.1x PBS，pH 7.6的50mL锥形管中，以在室温下除去过量的盐。在微阵列载玻片离心机中室温干燥。
7. 按照微阵列扫描仪制造商推荐的扫描方案，用微阵列扫描仪扫描幻灯片，分辨率为25μm或更高。
   注意:如果存在荧光素标记的生物素示踪剂，扫描绿色通道（例如:488 nm，em:509 nm）和对应于荧光染料缀合的二级抗体的通道，通常为红色（例如:635 nm，em :677nm）。扫描的目的是获得可以合并到单个.png文件中的单通道.tif文件（如第6.1节所述）。

6.使用ArrayNinja分析微阵列数据

1. 准备合并的微阵列图像
   注意:本节的目标是创建一个.png映像文件，它合并两个单通道.tif文件（在第5节中获得）。这个是与ArrayNinja分析模块兼容的唯一图像格式。以下说明代表了一种可能的方法来获取合并的图像文件。然而，其他解决方案可用（ 例如 ，免费的ImageJ）。
   1. 从安装了免费软件ImageMagick的计算机的bash终端中的命令行，导航到包含单个通道.tif文件的文件夹，并复制/粘贴以下步骤，在每个步骤之间进入"enter"（6.1.4 - 6.1 0.7）。
      注意:大写字母的文件名称（ 例如 ，RED_CHANNEL）应替换为微阵列幻灯片图像的文件名。
   2. 如有必要，首先使用命令'convert INPUT.tif -negate OUTPUT.tif'来反转图像。如果扫描器以白色信号保存.tif文件，并以黑色背景保存，则这是必需的。
      1. convert -depth 16 RED_CHANNEL.TIF -clone 0-channel GB -evaluate set 0 -delete 0 out.png 2> error.file。
      2. CONVert - depth 16 CONTROL_CHANNEL.TIF-克隆0通道RB -evaluate set 0 -delete 0 outa.png 2> error.file。
      3. convert -depth 16 CONTROL_CHANNEL.TIF -clone 0-channel RG -evaluate set 0 -delete 0 outB.png 2> error.file。
      4. convert out.png outa.png outB.png -set colorspace RGV -combine merged.png。
         注意:名为"merged.png"的文件将保存在与原始.tif文件相同的文件夹中。
2. 使用ArrayNinja量化数据
   1. 打开ArrayNinja，然后点击"量化具有已知源板的图像"下的相应微阵列打印机链接。在"装载板"对话框中输入保存的幻灯片设计的名称（步骤2.5），然后单击"进入"。 ArrayNinja分析模块的截图见图4 。
   2. 单击"选择文件"并导航到并选择第6.1节中创建的"merged.png"文件。合并的影像e将载入以及幻灯片布局的网格。
   3. 使用ArrayNinja控制面板底部的滑块调整对比度，亮度和中点。
      注意:这些调整仅用于可视化目的，对定量没有影响。
   4. 选择"分辨率"并输入与扫描图像的分辨率相匹配的值。使用"边缘"和"边缘顶部"将网格移动到与阵列上的点对齐。根据需要进行调整，使网格尽可能接近每个点。
   5. 点击"Spot Seek"，然后等到按钮返回到原始的灰色。
      注意:这可以重复几次，以将网格圆圈居中在各个点上。寻求功能使网格朝向每个点放松，以微调对齐。
   6. 将"超级数组"值更改为"1"以单独处理每个子数组面板（如果需要）。如果使用4x 12蜡印刷幻灯片布局（ 图3E ），使用"iPin""jPin"和"subA"控件关闭功能来分析任何所需的4×12孔组合。例如，为了分析左上和右上孔的重复，将iPin中输入"1 4"，将"1 1"输入"1"，将"1 4"输入"子"。按'enter'。
   7. 将鼠标悬停在各个位置以查看该功能的身份。
   8. 点击"切换缩放"更仔细地检查功能。当鼠标在一个点上时，按"R"键选择背景参考点。参考点将以橙色突出显示。
      注意:在"切换缩放"模式下，鼠标悬停的功能的放大图像显示在右上角。的额外的背景校正特征在ArrayNinja的详细讨论在别处讨论^28。
   9. 通过在将鼠标悬停在受影响的位置上的同时按"A"键，切断斑点（具有广泛变化的斑点形态或碎片，影响准确定量）。灭活点将变白。
   10. 点击"填充"，然后点击"提交"来量化点数。
       注意:一个新标签将打开并显示标准化为最亮斑点平均数据的条形图。条形图下面的表格包含归一化数据值和原始数据值。该表可以复制到电子表格中进行归档和进一步分析。

图4:ArrayNinja分析模块。显示ArrayNinja分析模块的屏幕截图。控制面板（左上角）显示了可调整的所有参数，以便可视化阵列，找到斑点，并对齐一个网格阵列图像。将鼠标悬停在功能上可显示放大视图（右上角），并显示包含与该功能相关联的识别信息（底部）的弹出窗口。用于背景校正的参考点为橙色。从下游分析中排除的特征是白色的。 ArrayNinja包含基于文本的搜索功能，以黄色突出显示匹配的功能，如H4K16的示例所示。 请点击此处查看此图的较大版本。

结果

该方案已被用于设计和制造用于分析组蛋白PTM抗体特异性的肽微阵列平台。该阵列查询了超过300个独特的肽特征（长度为20-40个残基）的文库，代表了核心和变体组蛋白³⁸上发现的许多已知PTM组合。该管道已经成为筛选许多广泛使用和市售的组蛋白PTM抗体的主力，并且在组蛋白抗体特异性数据库（www.histoneantibodies.com）上提供了完整的数据集。

讨论

在生物医学研究中的应用抗体可靠性是最重要的^46，47。在染色质生物化学中尤其如此，鉴于抗体的位置是开发用于表征组蛋白PTM的丰度和分布的大多数技术的关键工具。这里提出的方案详细介绍了用于分析组蛋白PTM抗体特异性的肽微阵列的设计，制造和使用的优化管线。该管道已被用于筛选大量市售和广泛使用的组蛋白PTM抗体，并且通过在线和扩展的?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Printing Buffer	ArrayIt	PPB
BSA	Omnipure	2390
Streptavidin-coated glass microscope slides	Greiner Bio-one	439003-25
polypropylene 384 well plate	Greiner Bio-one	784201
Biotin-fluorescein	Sigma	53608
contact microarray printer	Aushon	2470	Aushon 2470 Microarray Printer
contact microarray printer	Gene Machines	OmniGrid 100	OmniGrid Microarray Printer
PBS	Invitrogen	14190
Blocking Buffer	ArrayIt	SBB
Hydrophobic wax pen	Vector Labs	H-4000	ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen
Silicon Gasket	Grace Bio-labs	622511
Hybridization Vessel	Thermo Scientific	267061	or similar vessel
Fluorescent-dye conjugated secondary antibody	Life Technologies	A-21244	Alexa Fluor 647 (anti-rabbit)
Fluorescent-dye conjugated secondary antibody	Life Technologies	A-21235	Alexa Fluor 647 (anti-mouse)
Wax Imprinter	ArrayIt	MSI48
Tween-20	Omnipure	9490
Microarray Scanner	Innopsys	InnoScan 1100AL	or equivalent microarray scanner
EipTitan Histone Peptide Microarray	Epicypher	112001
AbSurance Pro Histone Peptide Microarray	Millipore	16668
MODified Histone Peptide Array	Active Motif	13001
Histone Code Peptide Microarrays	JPT	His_MA_01
Wax	Royal Oak	GulfWax	for wax imprinter
Humidified Microarray Slide Hybridization Chamber	VWR	97000-284
High throughput microscope slide washing chamber	ArrayIt	HTW
Microscope slide centrifuge	VWR	93000-204
Antibody 1	Abcam	8898
Antibody 2	Millipore	07-473
Biotinylated histone peptide	EpiCypher	12-0001	Example peptide. Similar peptides with various modifications are available from several commercial sources.
ImageMagick			https://www.imagemagick.org/script/index.php
ArrayNinja			https://rothbartlab.vai.org/tools/