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摘要

骨骼肌分化是一个高度动态的过程, 它特别依赖于核定位。在这里, 我们描述了一种方法, 以跟踪核运动的活细胞成像在成肌细胞分化和肌管形成, 并执行核动力学的定量表征, 从自动跟踪提取信息。

摘要

细胞内的核定位对于发育和再生过程中的多个细胞过程非常重要。核定位最有趣的例子发生在骨骼肌分化过程中。肌纤维 (肌纤维) 是由肌肉干细胞 (卫星细胞) 融合而成的多核细胞, 这些细胞经历增殖和分化。肌纤维内的正确核定位是正确的肌肉再生和功能所必需的。评估成肌细胞分化和肌纤维形成的常见程序依赖于免疫荧光分析的固定细胞, 这阻碍了随着时间的推移对核运动和细胞行为的研究。在这里, 我们描述了一种方法来分析成肌细胞分化和肌纤维形成的活细胞成像。我们提供了一个自动核跟踪软件, 以获得在分化和融合过程中核动力学和成肌细胞行为 (即轨迹) 的高通量定量表征。

引言

骨骼肌是人体最大的组织, 总数占人体质量的 35%-40% 1.卫星细胞是肌肉干细胞, 解剖上的特征是它们的位置 (并列于质膜, 在肌肉纤维的基层下), 从而导致成肌细胞 (成肌祖细胞) 的增殖, 最终区分并集成到现有的肌纤维和/或熔断器中, 形成新的肌纤维2,3,4。他们的发现和生物学研究的进展使人们对肌肉发育和再生有了重要的了解。

分离成肌细胞并将其分化为肌支管的协议早在多年前就已开发出来, 目前仍被广泛用于研究骨骼肌分化5, 6,7.然而, 这些方法大多代表了依赖于固定细胞分析的静态过程, 因此, 不允许科学家充分探索高度动态的过程, 如成肌细胞融合和肌纤维成熟。最突出的例子是核定位, 这是严格管制, 与原子核最初在肌纤维的中心, 然后, 位于周围的肌纤维成熟 8,9。实时成像是获得对这种特殊现象的进一步洞察的最适当的技术。

在这里, 我们描述了一种方法, 使科学家能够记录成肌细胞分化和肌管形成的延时显微镜, 并从自动跟踪成肌细胞核进行定量分析。该方法为分化和融合过程中的核动力学和成肌细胞行为提供了高通量的定量表征。该方案分为四个不同的部分, 即 (1) 从小鼠后肢收集肌肉, (2) 分离由机械和酶消化组成的原代成肌细胞, (3) 成肌细胞增殖和分化; (4)活体成像, 以跟踪成肌细胞分化前16小时内的细胞核。

在下面的过程中, 肌细胞从 H2B-gfp 小鼠中分离出来, 并用多西环素1μgml 进行治疗, 以诱导 H2B-gfp 表达, 如前面所述的 10。或者, 可以从其他在细胞核中表达荧光蛋白的转基因小鼠中分离成肌细胞, 也可以转染从野生小鼠体内分离出的细胞, 以表达细胞核中的荧光蛋白, 如 Pimentel 等人所述。9个。

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研究方案

所有涉及动物主题的程序都得到了圣拉斐尔机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 小鼠后肢肌肉的解剖

  1. 通过高压灭菌灭菌推子和剪刀 (直的和弯曲的)。
  2. 在开始实验之前, 准备和过滤所有介质 (阻滞介质、消化介质、增殖介质和差异介质) (见材料表)。
  3. 将5毫升磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 放入35毫米培养皿中, 用于肌肉采集。
  4. 用颈椎脱位或使用 co2 对小鼠进行牺牲 , 并用乙醇对皮肤进行消毒。用剪刀和推子将后肢和上肢的皮肤移开, 以方便肌肉的隔离。
    注: 肌肉可以从新生或成年小鼠中分离。与成年小鼠相比, 新生儿小鼠的卫星细胞数量有所增加。然而, 可以从一只成年老鼠中分离的卫星细胞总数足以进行下面描述的实验。
  5. 分离胫骨、单侧、伸肌长长 (EDL)、胃尾肌、四头肌和三头肌, 并将它们放入含有 PBS 的 Petri 培养皿中。把盘子放在冰上。用消毒剪刀和推子小心去除肌腱和脂肪。

2. 原生成肌细胞的分离

注: 细胞培养的所有程序都是在无菌条件下进行的。

  1. 从 PBS 中取出肌肉。通过使用无菌弯曲的剪刀切割和切碎肌肉, 直到获得均匀的质量。把肌肉块放入一个50毫升管。
  2. 在水浴中, 将消化培养基加入10毫升到肌肉块中, 在37°c 孵育 30分钟 (250分钟-1), 以酶质消化肌肉。
  3. 加入10毫升的杜尔贝科改良鹰培养基 (DMEM), 其中含有10% 的胎牛血清 (FBS)、1% 的谷氨酰胺、1% 的青霉素/链霉素和1% 的庆大霉素 (阻断培养基), 以阻止消化。
  4. 以 40 x g离心 5分钟, 并在50毫升管中收集上清液。把球团保存在冰上。
    注: 离心后, 上清液含有一些卫星细胞、血细胞、内皮细胞和成纤维细胞, 而颗粒含有未消化的肌肉和结缔组织碎片。为了增加分离细胞的数量, 颗粒必须经过额外的消化步骤, 如下所述。
  5. 以 650 x g 离心上清液 5分钟, 将上清液丢弃, 并在含有 10% FBS 的 Dmem 1 毫升中重新悬浮颗粒。把重新悬浮的颗粒放在冰上。
  6. 对步骤2.4 中获得的其余颗粒重复步骤 2.2-2.5 2倍, 并将随后重新悬浮的颗粒添加到保存在冰上的第一个重新悬浮的颗粒中。
  7. 通过70μm 的过滤器, 然后通过40μm 的过滤器, 将重新悬浮的颗粒通过。加入15毫升的 DMEM 与10% 的 FBS, 离心机在 650 x克5分钟。
  8. 在3毫升的红细胞裂解缓冲液中重新移植细胞颗粒, 以耗尽红细胞。在室温下孵化5分钟。加入40毫升的 PBS 以停止红细胞的裂解, 离心剂在 650 x g处冷却 5分钟, 取出上清液, 用10% 的 fbs 在 DMEM 的5毫升中重新悬浮颗粒。
  9. 作为预涂步骤, 将细胞在20毫升的增殖介质中, 在150毫米无涂层培养皿中。在细胞培养孵化器 (37°c, 5% CO2) 孵育1小时后, 收集培养基。
    注: 将连接在板上的成纤维细胞被丢弃, 而卫星细胞仍处于悬浮状态。
  10. 重复步骤 2.9 3x, 并在最后一个预置步骤中, 收集悬浮中包含卫星单元的介质。
  11. 离心机, 650 x 克 , 5分钟。
  12. 当细胞离心时, 用胶原蛋白 (0.1 m 醋酸中0.1% 溶液的10毫升) 覆盖两个150毫米 Petri 培养皿。要做到这一点, 把胶原蛋白放在盘子里, 孵育 5分钟, 然后取出。让盘子干燥30分钟。
  13. 丢弃第2.11 步中获得的上清液, 并在40毫升的增殖介质 (材料表) 中重新悬浮细胞颗粒。将细胞贴在两个胶原蛋白包覆的150毫米 Petri 培养皿上 (每盘20毫升), 并将细胞保留在细胞培养孵化器 (37°c, 5% co 2 , 5% o2)中的增殖培养基中 2-3天, 用1μgml 的多西环素诱导 h2b gfp 表达。
    注: 此步骤允许成肌细胞的增殖获得更多的细胞进行进一步的检测。细胞密度保持在很低的水平, 以避免成肌细胞自发分化为肌张力图。

3. 成肌细胞增殖和分化检测

注: 当成肌细胞密度较高时, 一些细胞会启动伸长率, 然后, 有必要分裂细胞。一般来说, 在不影响细胞表型的情况下, 可以2x–3x 分裂细胞。

  1. 丢弃介质, 用5毫升的 PBS 清洗细胞, 加入2毫升的胰蛋白酶 (1x), 在37°c 的细胞孵化器中孵育板 5分钟, 在显微镜下检查, 当圆形细胞分离时, 加入5毫升 DMEM 和 10% FBS 以灭活胰蛋白酶。数一数单元格的数量 (通常可以获得大约 1 x10 6 细胞/鼠标)。
    注: 用胰蛋白酶孵化5分钟通常足以分离增殖的成肌细胞。
  2. 将细胞进行下面描述的检测之一。
    1. 增殖分析
      1. 在胶原蛋白涂层的12孔板中的增殖培养基中的1万千井中板出 50, 000 细胞, 并在细胞培养孵化器 (37°c, 5% CO 2) 中孵育镀层细胞。在24小时、48小时或72小时修复和计数单元格。
        注: 介质每48小时更换一次, 以避免营养耗尽。
    2. 分化分析
      1. 涂布12孔板, 含350μl 的分化介质, 含基底膜基质 (1: 100)。在37°c 下将板材加氢 30分钟, 并取出介质。
      2. 板 200, 000 细胞在分化介质中的基质包衣板。在细胞培养孵化器 (37°c, 5% CO2, 5% o2) 中孵育细胞, 直到它们粘附在板上 (2小时一般足以使细胞粘附并开始分化)。
      3. 为了评估分化, 如前面所述, 对肌球蛋白重链和细胞核进行染色。或者, 执行现场成像分析, 如下所述。

4. 成肌细胞分化和核跟踪的实时成像

  1. 对于活细胞成像, 将在3.2.2 部分获得并在12孔板中镀的细胞置于共聚焦显微镜下, 配备了孵育系统, 使细胞保持在 5°c co 2 的 37°C.
  2. 使用20x 干目标 (0.7 NA) 获得数百个细胞的视野, 足以监测肌纤维的形成。H2B-GFP 细胞可以用低强度488纳米氩激光成像。
    注: 开放针孔可确保图像深度 (~ 10μm) 包含电池厚度, 以便在整个实验过程中保持单元格的焦点。使用共聚焦显微镜是有利的, 因为它提高了图像的信噪比, 虽然也可以使用广域显微镜。肌纤维的形成可以通过传输通道进行监测。
  3. 每隔 6分钟, 每16-bit 获取16位和 1, 024 x 1, 024 像素的图像。对于每个获取的位置, 生成一个多帧. tif 文件 (请参阅"补充文件" 中的示例)。
    注: 在本协议中, 使用了与显微镜 (材料表) 有关的商业软件;使用适当的软件在使用其他显微镜时实现相同的目标。
  4. 下载作为. zip补充文件提供的软件。
    注: 例程是必须在 MATLAB 中运行的脚本。该软件是对已发布的软件12的改编, 该软件经过优化, 用于跟踪肌管形成过程中的原子核。该软件分为两部分: 第一部分通过分割每个帧中的原子核来识别原子核, 而第二部分则生成原子核运动的 "轨迹" (轨迹)。补充文件中提供了完整的核分割和跟踪代码以及入门的分步指南。
  5. 提取 zip 文件, 并将其保存在所需的路径上的个人计算机 (PC) 正在使用。在已安装必要软件的电脑上执行以下所有段落。请注意,. zip 文件由三个文件夹组成, 如下所述。
    注:分段例程包含要为分割运行的函数。相反, 跟踪例程包含跟踪所需的功能。示例分段跟踪提供了熟悉系统的基本脚本和文件。用于分割和跟踪原子核的软件在 MATLAB、R2015 a 或更高版本中正常运行。
  6. 要从. tif 文件中分割原子核, 请命名该文件, 例如, namfile. tif.
    1. 打开"细分跟踪示例"文件夹, 然后单击"段式"。这将打开 MATLAB 中的命令窗口。
    2. 检查左侧的"当前文件夹"窗口, 以查看"分段跟踪示例" 文件夹中的所有元素。双击 "剂量分割".
      注: 有关必须在脚本中进行的修改的详细信息, 可在 stepbystepp. txt 文件中找到。必须修改脚本, 以便变量文件名输入是 filenameinput . tif, 文件夹输入是包含. tif 文件的文件夹.
    3. 运行脚本 (通过单击绿色的"运行"按钮)。分割的结果将保存为文件. mat(seg美格菲. mat), 而细胞核的分割可以在输出图中可视化。
      注: 如果需要, 可以修改脚本中描述的分割参数。可以使用脚本"检查分段" (请参阅 stepbystepp. txt 文件) 检查分割的质量。在此基础上, 如果分割质量较差 (只检测到几个原子核), 请调整分割的参数, 清楚地显示在do察门蒂m 脚本中, 并重复该过程。
  7. 要生成轨道 (即每个原子核的轨迹在时间), 使用在分割中获得的核位置, 运行脚本generatacks m 在同一个工作文件夹中。请务必添加正确的分段文件作为输入, 获得之前 (有关详细信息, 请参阅 stepbystepp. txt 文件)。
    注: 作为输出, 用户将获得一个文件trackednamefile.mat, 其中包含一个用于 x 坐标的矩阵和另一个用于生成轨道的 y 坐标的矩阵。
  8. 使用checkackingn 评估轨道的质量。使用最后一段的输出图, 帮助及时可视化每个原子核位置。在左侧检查是否有绿色十字架, 表示每个分段的细胞核。若要选择一个特定的原子核, 请使用较低的滚动条。请注意, 所选细胞核将以红色环绕, 而在右侧, 可以及时跟踪所选单元的轨迹 (通过使用上滚动条)。

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结果

要在活体成像中自动跟踪成肌细胞分化过程中的核运动, 核应优先进行荧光标记。需要注意的是, 使用 dna 插层分子是不可行的, 因为这些分子干扰原代成肌细胞13的增殖和分化。例如, 在有或没有 Hoechst 培养的原代成肌细胞中进行了增殖和分化分析 (图 1)。很明显, 在使用 Hoechst 33342 培养的成肌细胞中, 增殖 (1C

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讨论

肌肉纤维 (肌纤维) 是由肌肉干细胞 (卫星细胞) 的融合而形成的多核细胞, 这些细胞经历了 2,3的增殖和分化, 4. 我的工作是什么？为了评估成肌细胞的分化, 常见的程序包括培养成肌细胞在分化培养基和固定细胞在不同的时间点进行免疫荧光染色肌红器, 一个分化的标记, 和染色带 dna 插层分子 (例如, Hoechst)的细...

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披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

这项工作得到了 AFM-Telethon 至 e. v. (#21545) 和 Osedale San Raffaele (OSR) 对 s. z. 的种子赠款 (ZAMBRA5X1000) 的支持。巴斯德研究所图像分析中心的 Jean-yf·蒂涅克斯博士因公开分享他的 "简单跟踪者" MATLAB 例程而受到认可。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
chicken embryos extractSeralabCE-650-J
collagenaseSigmaC9263-1G125units/mg
collagen from calf skinSigmaC8919
dispaseGibco17105-0411.78 units/mg
doxyciclinSigmaD1515
DMEMSigmaD5671
fetal bovine serumLife technologies10270106
gentamicinSigmaG1397
Horse serumInvitrogen16050-098
Hoechstlife technologies33342
IMDMSigmaI3390
L-glutamineSigmaG7513
MatrigelCorning356231
penicillin-streptomycinSigmaP0781
red blood cells lysis mediumBiolegend420301
Digestion medium
collagenase40 mg
dispase70 mg
PBS20 ml
filtered 0.22um
Blocking medium
DMEM
Fetal bovine serum10%
L-glutammine1%
penicillin-streptomycin1%
gentamicin1 ‰
filtered 0.22um
proliferation medium
IMDM
Fetal bovine serum20%
L-glutammine1%
penicillin-streptomycin1%
gentamicin1 ‰
chichen embryo extract3%
filtered 0.22um
differentiation medium
IMDM
Horse serum2%
L-glutammine1%
penicillin-streptomycin1%
gentamicin1 ‰
chichen embryo extract1%
filtered 0.22um

参考文献

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