Exploitant imagerie direct aux noyaux de piste au cours de la différenciation des myoblastes et Fusion

Résumé

Différenciation musculaire squelettique est un processus très dynamique, qui s’appuie notamment sur positionnement nucléaire. Nous décrivons ici une méthode pour suivre les mouvements des noyaux par imagerie de cellules vivantes pendant la formation de différenciation et de myotubes myoblastes et d’effectuer une caractérisation quantitative de noyaux dynamique en extrayant les informations de suivi automatique.

Résumé

Un positionnement nucléaire au sein de cellules est important pour plusieurs processus cellulaires dans le développement et la régénération. L’exemple plus intrigant de positionnement nucléaire se produit au cours de la différenciation musculaire squelettique. Les fibres musculaires (fibres musculaires) sont des cellules multinucléées formés par la fusion de cellules précurseurs de muscle (myoblastes) dérivés de cellules souches musculaires (cellules satellites) qui subissent la prolifération et la différenciation. Bon positionnement nucléaire au sein des fibres musculaires est nécessaire pour la régénération musculaire correcte et la fonction. La procédure uniforme pour évaluer la formation la différenciation et de la fibre musculaire de myoblastes s’appuie sur les cellules fixes analysés par immunofluorescence, qui fait obstacle à l’étude du comportement de mouvement et de la cellule nucléaire au fil du temps. Nous décrivons ici une méthode pour l’analyse de formation de différenciation et de la fibre musculaire de myoblastes par imagerie de cellules vivantes. Nous fournissons un logiciel pour un suivi automatisé nucléaire afin d’obtenir une caractérisation quantitative de haut débit de dynamique nucléaire et le comportement de myoblastes (c.-à-d., la trajectoire) au cours de la différenciation et la fusion.

Introduction

Le muscle squelettique est un tissu plus grand dans le corps humain, pour un total de 35-40 % de la masse de corps¹. Cellules satellites sont des cellules souches musculaires, caractérisées anatomiquement par leur position (juxtaposée à la membrane plasmique, sous la couche basale des fibres musculaires), qui donnent lieu à la prolifération de myoblastes (progéniteurs myogéniques), qui finit par différencier et intégrer les myofibres existants et/ou fondre à forme nouvelle myofibres^2,3,4. Leur découverte et les progrès dans l’étude de leur biologie a conduit à un aperçu significatif de développement musculaire et la régénération.

Protocoles d’isoler et de se différencier de myoblastes en myotubes ont été mis au point il y a de nombreuses années et sont encore largement utilisés pour étudier les muscles squelettiques différenciation^5,6,7. Cependant, la plupart de ces méthodes représente les procédures statiques qui reposent sur l’analyse des cellules fixées et, par conséquent, ne permettent pas de scientifiques pour explorer pleinement les processus hautement dynamiques, telles que la fusion des myoblastes et de la maturation de la fibre musculaire. L’exemple le plus frappant est le positionnement nucléaire, qui est étroitement contrôlée, avec des noyaux au départ dans le centre de la fibre musculaire et, ensuite, situé à la périphérie après la fibre musculaire maturation^8,9. L’imagerie Live est la technique la plus appropriée pour obtenir de plus amples aperçus de ce phénomène étrange.

Nous décrivons ici une méthode qui permet aux scientifiques d’enregistrer des myoblastes différenciation et myotubes formation en time-lapse microscopie et pour effectuer des analyses quantitatives de la poursuite automatique des noyaux de myoblastes. Cette méthode fournit une caractérisation quantitative de haut débit de comportement dynamique et de myoblastes nucléaire au cours de la différenciation et la fusion. Le protocole est divisé en quatre parties différentes, à savoir (1) la collection des muscles des membres postérieurs des souris, (2) l’isolement des myoblastes primaires qui consiste dans la digestion mécanique et enzymatique, myoblastes (3) la prolifération et la différenciation et (4) vivre d’imagerie pour suivre les noyaux au cours des 16 premières heures de la différenciation des myoblastes.

Dans la procédure suivante, les myoblastes sont isolés de souris H2B-GFP et traités avec 1 µg/mL de doxycycline pour induire l’expression de la GFP-H2B, comme décrit précédemment¹⁰. Alternativement, il est possible d’isoler les myoblastes des autres souris transgéniques exprimant une protéine fluorescente dans le noyau ou à transfecter les cellules isolées de souris de type sauvage à exprimer une protéine fluorescente dans le noyau, tel que décrit par Pimentel et al. ⁹.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvées par le Comité de l’emploi et de San Raffaele Institutional Animal Care.

1. la dissection des muscles postérieurs de la souris

1. Stériliser les pinces et ciseaux (à la fois droites et courbes) à l’autoclave.
2. Préparer et filtrer (0,22 µm) tous les médias (blocage moyen, moyen de digestion, prolifèrent moyen et moyen de différencier) avant de commencer l’expérience (voir Table des matières).
3. Mettre 5 mL d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans une boîte de pétri pour collection de muscle de 35 mm.
4. Sacrifier la souris par dislocation cervicale ou à l’aide de CO₂ et stériliser la peau avec de l’éthanol. Enlever la peau des membres postérieurs et des membres supérieurs à l’aide de ciseaux et pince à épiler, afin de faciliter l’isolement des muscles.
   Remarque : Les Muscles peuvent être isolés de souris néonatales ou adultes. Les souris néonatales ont un nombre accru de cellules satellites par rapport à des souris adultes. Toutefois, le nombre total de cellules satellites qui peuvent être isolés dans une souris adulte seule est suffisant pour réaliser l’expérience décrite ci-dessous.
5. Isoler le muscle jambier, soléaire, extenseur commun des orteils (EDL), gastrocnémien, quadriceps et triceps et mettez-les dans le plat de pétri contenant du PBS. Laisser le plat sur la glace. Retirez soigneusement les tendons et la graisse avec des ciseaux stérilisés et pince à épiler.

2. isolement des myoblastes primaires

Remarque : Toutes les procédures pour la culture cellulaire sont effectuées dans des conditions stériles.

1. Retirez les muscles de la PBS. Couper et émincer les muscles, à l’aide de ciseaux courbes stérile, jusqu'à l’obtention d’une masse uniforme. Mettre les morceaux de muscle dans un tube de 50 mL.
2. Ajouter 10 mL de milieu digestion pour les morceaux de muscle et incuber à 37 ° C pendant 30 min sous forte agitation (250 min^-1) dans un bain d’eau, à digérer enzymatiquement les muscles.
3. Ajouter 10 mL de Dulbecco aigle modifié (DMEM) contenant 10 % sérum fœtal (SVF), glutamine 1 %, 1 % pénicilline/streptomycine et 1 % de gentamicine (blocage moyen) pour arrêter la digestion.
4. Centrifuger à 40 x g pendant 5 min et recueillir le surnageant dans un tube de 50 mL. Sauver le culot sur la glace.
   Remarque : Après la centrifugation, le surnageant contient certaines cellules satellites, cellules sanguines, les cellules endothéliales et fibroblastes, tandis que le granule contient des morceaux de muscle non digéré et du tissu conjonctif. Pour augmenter le nombre de cellules isolées, le culot doit être soumis à des mesures supplémentaires de la digestion tel que décrit ci-dessous.
5. Centrifuger le surnageant à 650 x g pendant 5 min. jeter le surnageant et resuspendre le culot dans 1 mL de DMEM contenant 10 % FBS. Garder l’extrait concentré sur la glace.
6. Répétez les étapes 2.2 – 2,5 x 2 pour le reste de l’extrait concentré obtenu à l’étape 2.4 et ajouter les boulettes ensuite remises en suspension pour le premier extrait concentré conservée sur la glace.
7. Passer les boulettes remises en suspension à travers un filtre à 70 µm, puis à travers un filtre à 40 µm. Ajouter 15 mL de DMEM avec 10 % de BF et centrifuger à 650 x g pendant 5 min.
8. Resuspendre le culot dans 3 mL de tampon de lyse des globules rouges pour épuiser les globules rouges. Il incuber pendant 5 min à température ambiante. Ajouter 40 mL de PBS à arrêter la lyse des globules rouges et centrifuger à 650 g pendant 5 min. Retirez le surnageant et resuspendre le culot dans 5 mL de DMEM avec 10 % FBS.
9. Comme étape prédorure, plaque les cellules dans 20 mL de milieu de prolifération dans un 150 mm non revêtus de pétri. Après 1 h d’incubation dans un incubateur de culture cellulaire (37 ° C, 5 % de CO₂), recueillir le milieu.
   Remarque : Les fibroblastes, fixation de la plaque, ensuite rejetées, alors que les cellules satellites restent en suspension.
10. Répétez l’étape 2,9 3 x et, à la dernière étape prédorure, recueillir le support qui contient les cellules satellites en suspension.
11. Centrifuger à 650 x g pendant 5 min.
12. Alors que les cellules sont centrifugation, enduire les deux plats de pétri de 150 mm avec le collagène (10 mL d’une solution à 0,1 % dans l’acide acétique 0,1 M). Pour ce faire, mettez le collagène sur la plaque, incuber pendant 5 min et retirez-le. Sécher la plaque pendant 30 min.
13. Éliminer le liquide surnageant obtenu à l’étape 2.11 et resuspendre le culot dans 40 mL de milieu de prolifération (Table des matières). Plaque de cellules de collagène-enduit 150 mm deux boîtes de pétri (20 mL par plat) et garder les cellules dans un incubateur de culture cellulaire (37 ° C, 5 % CO_2, 5 % O₂) dans le milieu de la prolifération pendant 2 – 3 jours avec 1 µg/mL de doxycycline pour induire l’expression de la H2B-GFP.
    Remarque : Cette étape permet la prolifération des myoblastes pour obtenir un plus grand nombre de cellules pour plus amples essais. La densité cellulaire est maintenue très basses afin d’éviter une différenciation spontanée des myoblastes en myotubes.

3. tests de prolifération et la différenciation myoblastes

Remarque : Lorsque myoblastes densité est élevée, certaines cellules initier l’élongation, et ensuite, il est nécessaire de séparer les cellules. Généralement, il est possible de fractionner les cellules 2 x x-3 sans affecter leur phénotype.

1. Ignorer le milieu, laver les cellules avec 5 mL de PBS, ajouter 2 mL de trypsine (1 x) et incuber les plaques à 37 ° C dans un incubateur à cellules pendant 5 min. vérifier au microscope et, lorsque les cellules rondes détachement, ajouter 5 mL de DMEM avec 10 % FBS pour inactiver la trypsine. Compter le nombre de cellules (généralement, il est possible d’obtenir environ 1 x 10⁶ cellules/souris).
   Remarque : L’Incubation avec la trypsine pendant 5 min est habituellement assez pour détacher les myoblastes proliférantes.
2. Soumettre les cellules à l’un des essais décrits ci-dessous.
   1. Essai de prolifération
      1. Plaque 50 000 cellules par puits dans 1 mL/bien du milieu de la prolifération dans une plaque de 12 puits de collagène-enduit et incuber les cellules plaqués dans un incubateur de culture cellulaire (37 ° C, 5 % de CO₂). Difficulté et compter les cellules à 24, 48 ou 72 h.
         NOTE : Le support est remplacé toutes les 48 h afin d’éviter l’épuisement des éléments nutritifs.
   2. Test de différenciation
      1. Recouvrir une plaque de 12 puits avec 350 µL de différenciation moyenne contenant membrane basale matrice (1/100). Incuber les plaques à 37 ° C pendant 30 min et retirer le support.
      2. Plaque de 200 000 cellules/puits dans le milieu de la différenciation dans la plaque matrice-enduit. Incuber les cellules dans un incubateur de culture cellulaire (37 ° C, 5 % CO_2, 5 % O₂) jusqu'à ce qu’ils adhèrent à la plaque (2 h sont généralement assez pour les cellules d’adhérer et de commencer la différenciation).
      3. Afin d’évaluer la différenciation, effectuer une coloration pour la chaîne lourde de myosine et noyaux comme décrit précédemment¹¹. Vous pouvez également effectuer des analyses de vivre-imagerie tel que décrit ci-dessous.

4. Live-imagerie de la différenciation des myoblastes et suivi nucléaire

1. Pour l’imagerie de cellules vivantes, mettre les cellules obtenues à la section 3.2.2 et plaqué dans une plaque de 12 puits, sous un microscope confocal, équipé d’un système d’incubation pour maintenir les cellules à 37 ° C à 5 % de CO₂.
2. Utilisez un objectif de sèche 20 x (NA 0,7) pour obtenir des champs de vision avec des centaines de cellules, assez pour suivre la formation de la fibre musculaire. Les cellules H2B-GFP peuvent être photographiées avec un laser à Argon faible intensité 488 nm.
   NOTE : Un trou d’épingle ouverte assure que la profondeur de l’image (~ 10 µm) contienne l’épaisseur de la cellule afin que les cellules sont conservées en bref tout au long de l’expérience. À l’aide d’un microscope confocal est avantageuse, car elle améliore le rapport signal-bruit des images, bien que la microscopie à champ large pourrait également être utilisée. Formation de la fibre musculaire peut être surveillée par le canal de transmission.
3. Acquisition d’images de 16 bits et 1 024 x 1 024 pixels par image toutes les 6 minutes pendant 16 h. Générer un fichier de multiframe.tif pour chaque position acquise, (voir l’exemple dans les Fichiers supplémentaires).
   Remarque : Dans le présent protocole, les logiciels commerciaux associés au microscope (Table des matières) a été utilisé ; Utilisez le logiciel approprié pour atteindre le même objectif lorsque vous utilisez d’autres microscopes.
4. Télécharger le logiciel fourni sous forme de.zip fichier supplémentaire.
   Remarque : Les routines sont des scripts qui doivent être exécutés en MATLAB. Le logiciel est une adaptation d’un logiciel publié¹² optimisé pour le suivi des noyaux pendant la formation des myotubes. Ce logiciel est divisé en deux parties : l’une identifie les noyaux dans chaque image en segmentant, tandis que l’autre génère des « pistes » (trajectoires) du mouvement des noyaux. Le code complet de la segmentation nucléaire et de suivi et d’un guide détaillé de mise en route sont fournis dans les Fichiers supplémentaires.
5. Extrayez le fichier zip et enregistrez-le dans un chemin d’accès souhaité sur l’ordinateur personnel (PC) en cours d’utilisation. Effectuer toutes les dessous de passages sur un PC avec le logiciel nécessaire déjà installé. Notez que le fichier .zip est composé de trois dossiers qui est mentionné ci-dessous.
   Remarque : Les Routines de Segmentation contient les fonctions à exécuter pour la segmentation. Routines de suivi, au contraire, contient les fonctions requises pour le suivi. Exemple de Segmentation suivi fournit les fichiers de se familiariser avec le système et les scripts de base. Le logiciel utilisé pour la segmentation et le suivi des noyaux s’exécute correctement dans MATLAB, R2015a ou versions ultérieures.
6. Pour segmenter les noyaux du fichier .tif, nommez le fichier, par exemple, NameFile.tif.
   1. Ouvrez le dossier Exemple Segmentation suivi et cliquez sur DoSegmentation.m. Ceci ouvrira la fenêtre de commande MATLAB.
   2. Vérifiez la fenêtre du Dossier en cours sur la gauche pour voir tous les éléments dans le dossier Exemple de Segmentation suivi . Double-cliquez sur DoSegmentation.m.
      NOTE : Des informations détaillées sur les modifications qui doivent être montés dans le script se trouvent dans le fichier StepbyStep.txt. Il est obligatoire de modifier le script pour que la variable filenameinput est NameFile.tif et folderinput correspond au dossier où figure le fichier .tif.
   3. Exécutez le script (en cliquant sur le vert bouton exécuter ). Le résultat de la segmentation est enregistré comme un file.mat (SegmentedNameFile.mat), tandis que la segmentation des noyaux peut être visualisée à la figure de sortie.
      Remarque : Les paramètres pour la segmentation, décrit dans le script, peuvent être modifiés si nécessaire. La qualité de la segmentation peut être vérifiée à l’aide du script CheckSegmentation.m (voir le fichier StepbyStep.txt). Sur cette base, si la qualité de la segmentation est faible (seulement quelques noyaux détectés), ajuster les paramètres de la segmentation, clairement indiqué dans le script DoSegmentation.m et répéter la procédure.
7. Pour générer les pistes (c.-à-d., les trajectoires de chacun des noyaux dans le temps), en utilisant les positions nucléaires obtenues dans la segmentation, exécutez le script GenerateTracks.m dans le même dossier de travail. N’oubliez pas d’ajouter le fichier de segmentation appropriée comme intrant, obtenus auparavant (voir le fichier StepbyStep.txt pour plus d’informations).
   Remarque : En tant que sortie, l’utilisateur obtiendra un fichier TrackedNameFile.mat, avec une matrice pour les coordonnées x et une autre matrice pour les coordonnées y de la voie ferrée générée.
8. Évaluer la qualité des pistes à l’aide de CheckTracking.m (voir le fichier StepbyStep.txt pour plus d’informations). Utilisez la figure de la sortie de ce dernier passage pour aider à visualiser chaque position de noyaux dans le temps. Vérifier sur la gauche pour les croix vertes qui indiquent chaque noyau segmenté. Pour sélectionner un noyau spécifique, utilisez la barre de défilement inférieure. Notez que le noyau sélectionné sera encerclé en rouge, tandis que sur la droite, la trajectoire de la cellule sélectionnée peut être suivie dans le temps (à l’aide de la barre de défilement supérieure).

Résultats

Pour suivre automatiquement les mouvement nucléaire au cours de la différenciation des myoblastes en imagerie live, les noyaux doivent préférentiellement être fluorescent étiquetés. Il est important de noter que l’à l’aide de molécules d’ADN-intercalation n’est pas possible car ces molécules interfèrent avec la prolifération et la différenciation des myoblastes primaires¹³. À titre d’exemple, la prolifération et la différenciation ont ét?...

Discussion

Les fibres musculaires (fibres musculaires) sont des cellules multinucléées qui sont formées par la fusion de cellules précurseurs de muscle (myoblastes) dérivée de cellules souches musculaires (cellules satellites) qui subissent la prolifération et la différenciation^{2,3, 4}. Afin d’évaluer la différenciation des myoblastes, la procédure commune consiste en cultivant des myoblastes au moyen de différenciation et de...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
chicken embryos extract	Seralab	CE-650-J
collagenase	Sigma	C9263-1G	125units/mg
collagen from calf skin	Sigma	C8919
dispase	Gibco	17105-041	1.78 units/mg
doxyciclin	Sigma	D1515
DMEM	Sigma	D5671
fetal bovine serum	Life technologies	10270106
gentamicin	Sigma	G1397
Horse serum	Invitrogen	16050-098
Hoechst	life technologies	33342
IMDM	Sigma	I3390
L-glutamine	Sigma	G7513
Matrigel	Corning	356231
penicillin-streptomycin	Sigma	P0781
red blood cells lysis medium	Biolegend	420301
Digestion medium
collagenase	40 mg
dispase	70 mg
PBS	20 ml
filtered 0.22um
Blocking medium
DMEM
Fetal bovine serum	10%
L-glutammine	1%
penicillin-streptomycin	1%
gentamicin	1 ‰
filtered 0.22um
proliferation medium
IMDM
Fetal bovine serum	20%
L-glutammine	1%
penicillin-streptomycin	1%
gentamicin	1 ‰
chichen embryo extract	3%
filtered 0.22um
differentiation medium
IMDM
Horse serum	2%
L-glutammine	1%
penicillin-streptomycin	1%
gentamicin	1 ‰
chichen embryo extract	1%
filtered 0.22um