Explotando en la proyección de imagen a los núcleos de la pista durante la fusión y diferenciación de mioblastos

Resumen

Diferenciación del músculo esquelético es un proceso altamente dinámico, que particularmente se basa en posición nuclear. Aquí, describimos un método para seguir los movimientos de los núcleos de proyección de imagen de vivo de la célula durante la diferenciación y myotube formación de mioblastos y se realiza una caracterización cuantitativa de la dinámica de los núcleos de extracción de información de seguimiento automático.

Resumen

Posicionamiento nuclear dentro de las células es importante para múltiples procesos celulares en el desarrollo y regeneración. El ejemplo más fascinante del posicionamiento nuclear ocurre durante la diferenciación del músculo esquelético. Las fibras musculares (myofibers) está formadas por la fusión de células precursoras de músculo (mioblastos) derivadas de células madre de músculo (células satélite) que experimentan la proliferación y diferenciación de células multinucleadas. Correcta posición nuclear en myofibers es necesaria para la regeneración muscular adecuada y la función. El procedimiento común para evaluar la formación de la diferenciación y del myofiber mioblastos se basa en las células fijas analizadas por inmunofluorescencia, que impide el estudio del comportamiento de movimiento y de la célula nuclear con el tiempo. Aquí, describimos un método para el análisis de diferenciación y myofiber formación de mioblastos por proyección de imagen de células vivas. Ofrecemos un software para el seguimiento automatizado nuclear obtener una caracterización cuantitativa de alto rendimiento de nuclear dinámica y comportamiento de mioblastos (es decir, la trayectoria) durante la diferenciación y la fusión.

Introducción

Músculo esquelético es el tejido más grande del cuerpo humano, por un total de 35% - 40% de la masa del cuerpo¹. Las células satélite son células madre de músculo, caracterizadas anatómicamente por su posición (yuxtapuesto a la membrana plasmática, por debajo de la lámina basal de las fibras musculares), que dan lugar a la proliferación de mioblastos (células progenitoras miogénica), que eventualmente diferenciar e integrar en myofibers existentes o fusible forma nuevo myofibers^2,3,4. Su descubrimiento y los avances en el estudio de su biología ha llevado a importantes conocimientos en desarrollo muscular y la regeneración.

Protocolos para aislar y diferenciar mioblastos a miotubos han sido desarrollados hace muchos años y siguen siendo ampliamente utilizados para el estudio de diferenciación de músculo esquelético^5,6,7. Sin embargo, la mayoría de estos métodos representan procedimientos estáticos que se basan en el análisis de las células fijas y, en consecuencia, no permiten a los científicos explorar procesos altamente dinámicos, como la fusión de mioblastos y maduración del myofiber. El ejemplo más llamativo es nuclear, que es estrictamente regulado, con los núcleos inicialmente en el centro de la myofiber y, luego, situado en la periferia después myofiber maduración^8,9. En proyección de imagen es la técnica más adecuada para obtener mayor información sobre un fenómeno tan peculiar.

Aquí, describimos un método que permite a los científicos realizar diferenciación y myotube formación de mioblastos por microscopia Time-lapse y realizar análisis cuantitativos de seguimiento automático de núcleos mioblastos. Este método proporciona una caracterización cuantitativa de alto rendimiento de comportamiento dinámica y mioblastos nuclear durante la diferenciación y la fusión. El protocolo se divide en cuatro partes diferentes, a saber: (1) la colección de músculos de los miembros posteriores de los ratones, (2) el aislamiento de mioblastos primario que consiste en la digestión mecánica y enzimática, la proliferación de mioblastos (3) y la diferenciación y (4) en vivo imagen de seguimiento de núcleos dentro de las 16 h de la diferenciación de mioblastos.

En el procedimiento siguiente, mioblastos aislados de ratones H2B-GFP y tratados con 1 μg/mL de doxiciclina para inducir la expresión de GFP H2B, como se describió anteriormente¹⁰. Alternativamente, es posible aislar los mioblastos de otros ratones transgénicos que expresan una proteína fluorescente en el núcleo o transfectar las células aisladas de ratones de tipo salvaje para expresar una proteína fluorescente en el núcleo, como se describe por Pimentel et al. ⁹.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales sujetos fueron aprobados por el San Raffaele institucional Animal cuidado y uso.

1. disección de los músculos del miembro posterior del ratón

1. Esterilice en autoclave pinzas y tijeras (rectas y curvas).
2. Preparar y filtro (0,22 μm) todos los medios de comunicación (bloqueo medio, medio de digestión, medio de la proliferación y diferenciando medio) antes de empezar el experimento (véase Tabla de materiales).
3. Colocar 5 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) en una placa de Petri para la colección de músculo de 35 mm.
4. Sacrificar el ratón mediante dislocación cervical o mediante el uso de CO₂ y esteriliza la piel con etanol. Retirar la piel de los miembros posteriores y los miembros superiores mediante el uso de tijeras y pinzas, para facilitar el aislamiento de los músculos.
   Nota: Los músculos pueden ser aislados de ratones adultos o neonatales. Ratones neonatales tienen un mayor número de células satélite en comparación con ratones adultos. Sin embargo, el número total de las células satélite que puede ser aislado de un ratón adulto solo es suficiente para realizar el experimento que se describe a continuación.
5. Aislar tibialis, sóleo, extensor digitorum longus (EDL), gastrocnemio, cuádriceps y tríceps y ponerlos en el plato de Petri con PBS. Deja el plato en el hielo. Retire con cuidado los tendones y la grasa con tijeras esterilizadas y pinzas.

2. aislamiento de mioblastos primarios

Nota: Todos los procedimientos para el cultivo celular se realizan en condiciones estériles.

1. Quitar los músculos del PBS. Corte y pique los músculos mediante el uso de tijeras curvas estériles, hasta obtener una masa uniforme. Poner los trozos de músculo en un tubo de 50 mL.
2. Añadir 10 mL del medio de digestión a los trozos de músculo e incubar a 37 ° C durante 30 min con agitación fuerte (250 min^-1) en un baño de agua, digestión enzimático de los músculos.
3. Añadir 10 mL de Dulbecco modificado medio del águila (DMEM) con 10% suero bovino fetal (FBS), 1% glutamina, 1% de penicilina/estreptomicina y gentamicina 1% (medio bloqueo) para detener la digestión.
4. Centrifugue a 40 x g durante 5 min y recoger el sobrenadante en un tubo de 50 mL. Guardar el sedimento en el hielo.
   Nota: Después de la centrifugación, el sobrenadante contiene algunas células satélite, las células sanguíneas, células endoteliales y fibroblastos, mientras que el sedimento contiene pedazos de músculo sin digerir y tejido conectivo. Para aumentar el número de células aisladas, los pellets deben someterse a medidas adicionales de digestión como se describe a continuación.
5. Centrifugar el sobrenadante a 650 x g por 5 min, descartar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 1 mL de DMEM con 10% FBS. Mantenga resuspendido en el hielo.
6. Repita los pasos 2.2-2.5 x 2 para el resto del precipitado obtenido en el paso 2.4 y añadir los pellets posteriormente resuspendidos a primera resuspendido conservado en hielo.
7. Pasar los pellets resuspendidos a través de un filtro μm 70 y luego a través de un filtro μm 40. Añadir 15 mL de DMEM con 10% FBS y centrifugar a 650 x g durante 5 minutos.
8. Resuspender el precipitado de células en 3 mL de tampón de lisis de glóbulos rojos a agotar los glóbulos rojos. Incubar por 5 min a temperatura ambiente. Añadir 40 mL de PBS para detener la lisis de los glóbulos rojos y centrifugar a 650 x g durante 5 minutos Retire el sobrenadante y resuspender el precipitado en 5 mL de DMEM con 10% FBS.
9. Como paso preplating, placa las células en 20 mL de medio de proliferación en caja Petri 150 mm sin recubrir. Después de 1 h de incubación en una incubadora de cultivo celular (37 ° C, 5% CO₂), recoge el medio.
   Nota: Fibroblastos, fijación a la placa, son entonces desechados, mientras que las células satélite permanecen en suspensión.
10. Repita el paso 2,9 3 x y, en el último paso preplating, recoge el medio que contiene las células satélite en suspensión.
11. Centrifugar a 650 x g durante 5 minutos.
12. Mientras que las células son la centrifugación, la capa dos platos de Petri de 150 mm con colágeno (10 mL de una solución al 0.1% en ácido acético de 0,1 M). Para ello, poner el colágeno en la placa, incube durante 5 minutos y retírela. Deje la placa secar durante 30 minutos.
13. Deseche el sobrenadante obtenido en el paso 2.11 y resuspender el precipitado de células en 40 mL de medio de proliferación (Tabla de materiales). Las células en dos platos de Petri recubiertas de colágeno 150 mm (20 mL por caja) de la placa y mantener las células en una incubadora de cultivo celular (37 ° C, 5% CO_2, 5% O₂) en medio de la proliferación de 2 – 3 días con 1 μg/mL de doxiciclina para inducir la expresión de GFP H2B.
    Nota: Este paso permite la proliferación de mioblastos para obtener un número mayor de células para otros ensayos. Densidad celular se mantiene muy baja para evitar una diferenciación espontánea de mioblastos a miotubos.

3. ensayos de proliferación y diferenciación de mioblastos

Nota: Cuando mioblastos la densidad es alta, algunas células inician la elongación, y entonces, es necesario dividir las células. En general, es posible dividir las células 2 x-3 x sin afectar a su fenotipo.

1. Descartar el medio, lavan las células con 5 mL de PBS, añadir 2 mL de tripsina (1 x), incubar la placa a 37 ° C en un incubador celular 5 minutos comprobar al microscopio y cuando separar células redondas, añadir 5 mL de DMEM con 10% FBS para inactivar la tripsina. Contar el número de células (generalmente es posible obtener aproximadamente 1 x 10⁶ células/ratón).
   Nota: Incubación con tripsina para 5 minutos suele ser suficiente para separar la proliferación de mioblastos.
2. Someter las células a uno de los ensayos que se describen a continuación.
   1. Ensayo de proliferación
      1. 50.000 células/pozo en 1 mL o bien medio de proliferación en una placa de 12 pozos recubiertas de colágeno de la placa e incubar las células plateadas en una incubadora de cultivo celular (37 ° C, 5% CO₂). Fijar y contar las células en 24, 48 o 72 h.
         Nota: El medio es reemplazado cada 48 h para evitar el agotamiento de nutrientes.
   2. Ensayo de diferenciación
      1. Cubrir una placa de 12 pozos con 350 μl de la matriz de la membrana del sótano que contiene medio diferenciación (1: 100). Incubar la placa a 37 ° C durante 30 minutos y quitarlo del medio.
      2. Placa de 200.000 células/pozo en el medio de diferenciación en la placa revestida de matriz. Incubar las células en una incubadora de cultivo celular (37 ° C, 5% CO_2, 5% O₂) hasta que se adhieren a la placa (2 h suelen ser suficiente para que las células se adhieren y diferenciación).
      3. Para evaluar la diferenciación, realizar tinción de cadena pesada de miosina y núcleos como se describió anteriormente¹¹. Como alternativa, realizar análisis de imágenes en vivo como se describe a continuación.

4. imágenes en vivo de la diferenciación de mioblastos y seguimiento nuclear

1. Para celular directo imágenes, poner las células, obtenidas en la sección 3.2.2 y plateado en una placa de 12 pozos, microscopio confocal, equipada con un sistema de incubación para mantener las células a 37 ° C en 5% CO₂.
2. Utilice un objetivo seco de 20 x (0,7 NA) para obtener campos de vista con cientos de células, lo suficiente para controlar la formación del myofiber. Células de H2B-GFP pueden ser reflejadas con un láser de argón de baja intensidad de 488 nm.
   Nota: Un agujero de alfiler abierto asegura que la profundidad de la imagen (~ 10 μm) contiene el grueso de la célula de modo que las células se mantienen en foco durante todo el experimento. Utilizando un microscopio confocal es ventajoso ya que mejora la relación señal a ruido de las imágenes, aunque también se podría utilizar microscopía de amplio campo. Formación del Myofiber puede controlarse a través del canal de transmisión.
3. Adquisición de imágenes de 16 bits y 1.024 x 1.024 píxeles por fotograma cada 6 minutos durante 16 horas. Para cada posición adquirida, generar un archivo multiframe.tif (ver ejemplo en los Archivos complementarios).
   Nota: En el presente Protocolo, software comercial asociado con el microscopio (Tabla de materiales) se ha utilizado; Utilice el software apropiado para lograr el mismo objetivo al usar otros microscopios.
4. Descargar el software suministrado como un.zip archivo complementario.
   Nota: Las rutinas son scripts que deben ejecutarse en MATLAB. El software es una adaptación de un software publicado¹² optimizado para el seguimiento de los núcleos durante la formación de myotube. Este software está dividido en dos partes: la primera de ellas identifica los núcleos de cada marco por segmentación, mientras que el segundo genera "pistas" (trayectorias) del movimiento de los núcleos. El código completo de segmentación nuclear y seguimiento y una guía paso a paso para empezar se encuentran en los Archivos complementarios.
5. Extraiga el archivo zip y guardarlo en una ruta deseada en el ordenador personal (PC) en uso. Llevar a cabo todo el debajo de pasos en un PC con el software necesario instalado. Tenga en cuenta que el archivo .zip se compone de tres carpetas mencionadas anteriormente.
   Nota: Las rutinas de segmentación contiene las funciones a ejecutar para la segmentación. Seguimiento de rutinas, en cambio, contiene las funciones necesarias para el seguimiento. Ejemplo de segmentación de seguimiento proporciona los scripts básicos y archivos para familiarizarse con el sistema. El software utilizado para la segmentación y seguimiento de los núcleos funciona correctamente en MATLAB, R2015a o versiones posteriores.
6. Para segmentar los núcleos desde el archivo .tif, nombre del archivo, por ejemplo, NameFile.tif.
   1. Abra la carpeta Ejemplo segmentación seguimiento y haga clic en DoSegmentation.m. Se abrirá la ventana de comandos de MATLAB.
   2. Compruebe la ventana de la Carpeta actual a la izquierda para ver todos los elementos en la carpeta de Ejemplo de segmentación de seguimiento . Haga doble clic en DoSegmentation.m.
      Nota: Puede encontrarse información detallada sobre las modificaciones que deben hacerse en la secuencia de comandos en el archivo StepbyStep.txt. Es obligatorio modificar el script para que la variable filenameinput es NameFile.tif y folderinput es la carpeta donde se encuentra el archivo .tif.
   3. Ejecutar el script (haciendo clic en el verde botón Ejecutar ). El resultado de la segmentación se guardará como un file.mat (SegmentedNameFile.mat), mientras que la segmentación de los núcleos se puede visualizar en la figura de la salida.
      Nota: Los parámetros para la segmentación, que se describe en la escritura, pueden ser modificados si es necesario. La calidad de la segmentación puede ser comprobada utilizando el script CheckSegmentation.m (véase el archivo de StepbyStep.txt). Basados en esto, si la calidad de la segmentación es pobre (sólo de unos pocos núcleos detectados), ajustar los parámetros de la segmentación, claramente indicado en el script de DoSegmentation.m y repita el procedimiento.
7. Para generar las pistas (es decir, las trayectorias de cada uno de los núcleos en el tiempo), usando las posiciones nucleares obtenidos en la segmentación, ejecute el script GenerateTracks.m en la misma carpeta de trabajo. Asegúrese de agregar el archivo correcto de segmentación como entrada, obtenidos antes (véase el archivo StepbyStep.txt para más información).
   Nota: Como resultado, el usuario obtendrá un archivo TrackedNameFile.mat, con una matriz para las coordenadas x y otra matriz para las coordenadas y de las pistas generadas.
8. Evaluar la calidad de las pistas usando CheckTracking.m (consulte el archivo StepbyStep.txt para más información). Utilice la figura de la salida de este último pasaje para visualizar cada posición de los núcleos en el tiempo. Echale un vistazo a la izquierda para cruces verdes que indican cada núcleo segmentado. Para seleccionar un núcleo específico, utilice la barra de desplazamiento inferior. Tenga en cuenta que el núcleo seleccionado será un círculo en rojo, mientras que a la derecha, la trayectoria de la celda seleccionada puede seguirse en el tiempo (mediante el uso de la barra de desplazamiento superior).

Resultados

Para seguir automáticamente movimiento nuclear durante la diferenciación de mioblastos en proyección de imagen de vivo, los núcleos deben preferentemente fluorescente etiquetarse. Es importante tener en cuenta que utilizando moléculas intercalantes de ADN no es factible porque estas moléculas interfieren con la proliferación y diferenciación de mioblastos primarios¹³. Por ejemplo, proliferación y diferenciación han sido analizados en primaria mioblastos c...

Discusión

Las fibras musculares (myofibers) son células multinucleadas que se forman por la fusión de las células musculares precursores (mioblastos) derivada de células madre de músculo (células satélite) que experimentan la proliferación y diferenciación^{2,3, 4}. Para evaluar la diferenciación de mioblastos, el procedimiento común consiste en el cultivo de mioblastos en diferenciar el medio y la fijación de las células en di...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
chicken embryos extract	Seralab	CE-650-J
collagenase	Sigma	C9263-1G	125units/mg
collagen from calf skin	Sigma	C8919
dispase	Gibco	17105-041	1.78 units/mg
doxyciclin	Sigma	D1515
DMEM	Sigma	D5671
fetal bovine serum	Life technologies	10270106
gentamicin	Sigma	G1397
Horse serum	Invitrogen	16050-098
Hoechst	life technologies	33342
IMDM	Sigma	I3390
L-glutamine	Sigma	G7513
Matrigel	Corning	356231
penicillin-streptomycin	Sigma	P0781
red blood cells lysis medium	Biolegend	420301
Digestion medium
collagenase	40 mg
dispase	70 mg
PBS	20 ml
filtered 0.22um
Blocking medium
DMEM
Fetal bovine serum	10%
L-glutammine	1%
penicillin-streptomycin	1%
gentamicin	1 ‰
filtered 0.22um
proliferation medium
IMDM
Fetal bovine serum	20%
L-glutammine	1%
penicillin-streptomycin	1%
gentamicin	1 ‰
chichen embryo extract	3%
filtered 0.22um
differentiation medium
IMDM
Horse serum	2%
L-glutammine	1%
penicillin-streptomycin	1%
gentamicin	1 ‰
chichen embryo extract	1%
filtered 0.22um