Explorando a imagem ao vivo aos núcleos de pista durante a diferenciação de Myoblast e fusão

Resumo

Diferenciação de músculo esquelético é um processo altamente dinâmico, que particularmente se baseia no posicionamento nuclear. Aqui, descrevemos um método para controlar movimentos de núcleos por imagens de células vivas durante a formação de diferenciação e myotube myoblast e executar uma caracterização quantitativa da dinâmica de núcleos extraindo informações de rastreamento automático.

Resumo

Posicionamento nuclear dentro de células é importante para vários processos celulares em desenvolvimento e regeneração. O exemplo mais intrigante de posicionamento nuclear ocorre durante a diferenciação do músculo esquelético. Fibras musculares (myofibers) são células multinucleadas, formadas pela fusão de células precursoras dos músculos (mioblastos) derivadas de células-tronco musculares (células satélites) que se submetem a proliferação e diferenciação. Correto posicionamento nuclear dentro de myofibers é necessária para a regeneração muscular adequada e função. O procedimento comum para avaliar a formação de diferenciação e miofibras myoblast se baseia em células fixas analisadas por imunofluorescência, que dificulta o estudo do comportamento de movimento e célula nuclear ao longo do tempo. Aqui, descrevemos um método para a análise da formação de diferenciação e miofibras myoblast por imagens de células vivas. Nós fornecemos um software automatizado de controle nuclear obter uma caracterização quantitativa da elevado-produção de nuclear dinâmica e comportamento de myoblast (ou seja, a trajetória) durante a diferenciação e fusão.

Introdução

Músculo esquelético é o tecido maior no corpo humano, totalizando 35% - 40% da massa do corpo¹. Células satélites são células-tronco musculares, anatomicamente caracterizadas por sua posição (justaposta a membrana plasmática, por baixo da lâmina basal das fibras musculares), que dão origem à proliferação de mioblastos (células progenitoras miogênico), que eventualmente diferenciar e integrar myofibers existentes e/ou fusível para formulário novo myofibers^2,3,4. O progresso no estudo de sua biologia e sua descoberta levou a insights significativos sobre o desenvolvimento muscular e regeneração.

Protocolos para isolar e diferenciar mioblastos em myotubes foram desenvolvidos há muitos anos e ainda são largamente usados para estudar o músculo esquelético diferenciação^5,6,7. No entanto, a maioria desses métodos representa procedimentos estáticos que dependem da análise de células fixas e, consequentemente, não permitir que os cientistas a explorar plenamente os processos altamente dinâmicos, como fusão de myoblast e maturação de miofibras. O exemplo mais marcante é o posicionamento nuclear, que é fortemente regulamentado, com núcleos inicialmente no centro das miofibras e, em seguida, localizada na periferia das miofibras maturação^8,9. Imagem ao vivo é a técnica mais apropriada para obter ainda mais insights sobre um fenômeno tão peculiar.

Aqui, descrevemos um método que permite aos cientistas para gravar myoblast formação de diferenciação e myotube pela microscopia de lapso de tempo e realizar análises quantitativas do rastreamento automático de núcleos myoblast. Este método fornece uma caracterização quantitativa da elevado-throughput de nuclear dinâmica e myoblast comportamento durante a diferenciação e fusão. O protocolo é dividido em quatro partes diferentes, ou seja, (1) a coleção dos músculos de um dos membros posteriores dos ratos, (2) o isolamento dos mioblastos primários que consiste na digestão enzimática e mecânico, (3) myoblast proliferação e diferenciação e (4) viva da imagem latente para rastrear núcleos dentro o primeiro 16 h de diferenciação myoblast.

No procedimento a seguir, mioblastos são isolados de ratos H2B-GFP e tratados com 1 µ g/mL de doxiciclina para induzir a expressão H2B-GFP, como descrito anteriormente,¹⁰. Alternativamente, é possível isolar os mioblastos de outros ratos transgénicos que expressam uma proteína fluorescente no núcleo ou transfect as células isoladas de ratos do selvagem-tipo de expressar uma proteína fluorescente no núcleo, conforme descrito por Pimentel et al. ⁹.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo assuntos animais foram aprovados pelo Comitê de uso e San Raffaele institucional Cuidado Animal.

1. a dissecação dos músculos do membro posterior de rato

1. Esterilize as pinças e tesouras (retas e curvas) em autoclave.
2. Preparar e filtro (0,22 µm) todas as mídias (bloqueio médio, médio de digestão, proliferando médio e diferenciando médio) antes de iniciar o experimento (ver Tabela de materiais).
3. Colocar 5 mL de tampão fosfato salino (PBS) em uma placa de Petri para coleção de músculo de 35mm.
4. Sacrificar o mouse por deslocamento cervical ou usando o CO₂ e esterilizar a pele com álcool etílico. Retire a pele dos membros superiores e membros posteriores usando uma tesoura e pinça, a fim de facilitar o isolamento dos músculos.
   Nota: Os músculos podem ser isolados de ratos neonatais ou adultos. Os ratos neonatais têm um aumento do número de células satélites em comparação com ratos adultos. No entanto, o número total de células satélites que pode ser isolado de um único rato adulto é suficiente para realizar o experimento descrito abaixo.
5. Isolar o tibial, extensor longo dos dedos (EDI), sóleo, gastrocnêmio, quadríceps e tríceps e colocá-los na caixa de Petri contendo PBS. Deixe o prato no gelo. Retire cuidadosamente os tendões e gordura com pinça e tesoura esterilizada.

2. isolamento de mioblastos primários

Nota: Todos os procedimentos para cultura de células são feitos em condições estéreis.

1. Remova os músculos a PBS. Cortar e picar os músculos, usando tesouras curvas estéril, até obter uma massa uniforme. Coloque os pedaços de músculo em um tubo de 50 mL.
2. Adicionar 10 mL do meio de digestão para os pedaços de músculo e incubar a 37 ° C por 30 min, sob forte agitação (250 min^-1) em um banho de água, para digerir enzimaticamente os músculos.
3. Adicione 10 mL de Dulbecco modificado médio da águia (DMEM) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS), glutamina 1%, 1% penicilina/estreptomicina e gentamicina 1% (bloqueio médio) para parar a digestão.
4. Centrifugar a 40 x g por 5 min e recolher o sobrenadante em um tubo de 50 mL. Salve a pelota no gelo.
   Nota: Após a centrifugação, o sobrenadante contém algumas células satélites, células sanguíneas, células endoteliais e fibroblastos, enquanto a pelota contém pedaços de músculo não digerido e tecido conjuntivo. Para aumentar o número de células isoladas, a pelota deve ser submetida a etapas adicionais de digestão conforme descrito abaixo.
5. Centrifugue o sobrenadante a 650 x g por 5 min. descartar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 1 mL de DMEM contendo 10% FBS. Manter o ressuspenso em gelo.
6. Repita as etapas de 2.2 – 2,5 x 2 para o resto do pellet obtido na etapa 2.4 e adicionar as pelotas posteriormente ressuspensa primeiro ressuspenso conservado no gelo.
7. Passe as ressuspensão de pelotas através de um filtro de 70 µm e, em seguida, através de um filtro de 40 µm. Adicione 15 mL de DMEM com 10% FBS e centrifugar a 650 x g por 5 min.
8. Ressuspender as células em 3 mL de tampão de lise de células vermelhas do sangue para esgotar os glóbulos vermelhos. -Incube durante 5 min à temperatura ambiente. Adicionar 40 mL de PBS para parar a Lise das células vermelhas do sangue e centrifugar a 650 x g por 5 min. Retire o sobrenadante e ressuspender o em 5 mL de DMEM com 10% FBS.
9. Como passo preplating, as células em 20 mL de meio de proliferação em uma placa de Petri 150 mm sem revestimento da placa. Após 1 h de incubação numa incubadora de cultura celular (37 ° C, 5% CO₂), recolha o meio.
   Nota: Fibroblastos, anexar a placa, então são descartados, enquanto as células satélites permanecem em suspensão.
10. Repita a etapa 2,9 3 x e, no último passo preplating, recolher o meio, que contém as células satélites em suspensão.
11. Centrifugar a 650 x g por 5 min.
12. Enquanto as células são centrifugação, revesti dois pratos de Petri 150mm com colágeno (10 mL de uma solução 0,1% de ácido acético 0,1 M). Para fazer isso, coloque o colágeno no prato, incubar durante 5 min e removê-lo. Deixe a placa secar por 30 min.
13. Descartar o sobrenadante obtido na etapa 2.11 e ressuspender as células em 40 mL de meio de proliferação (Tabela de materiais). As células em dois pratos de Petri 150mm revestida de colágeno (20 mL por prato) da placa e manter as células em uma incubadora de cultura celular (37 ° C, 5% CO_2, 5% O₂) em meio de proliferação por 2 – 3 dias com 1 µ g/mL de doxiciclina para induzir a expressão H2B-GFP.
    Nota: Este passo permite a proliferação de mioblastos para obter um maior número de células para mais ensaios. Densidade da célula é mantida muito baixa, para evitar uma diferenciação espontânea dos mioblastos em myotubes.

3. ensaios de proliferação e diferenciação de Myoblast

Nota: Quando myoblast densidade é elevada, algumas células iniciar o alongamento, e em seguida, é necessário dividir as células. Geralmente, é possível dividir células 2 x x-3 sem afetar seu fenótipo.

1. Descartar o meio, lavar as células com 5 mL de PBS, adicionar 2 mL de tripsina (1x) e incubar a placa a 37 ° C numa incubadora de célula 5 min. Verifique sob o microscópio e, quando cilìndricas desanexar, adicionar 5 mL de DMEM com 10% FBS para inactivar a tripsina. Contar o número de células (geralmente é possível obter cerca de 1 x 10⁶ células/rato).
   Nota: A incubação com tripsina por 5 min geralmente é suficiente para separar os mioblastos proliferando.
2. Submeta as células a um dos ensaios descritos a seguir.
   1. Ensaio de proliferação
      1. Placa de 50.000 células/poço em 1 mL/bem do meio de proliferação em um colágeno-revestido 12 placa e incubar as células chapeadas em uma incubadora de cultura celular (37 ° C, 5% CO₂). Corrigir e contar as células em 24, 48 ou 72 h.
         Nota: O meio é substituído a cada 48 h para evitar o esgotamento de nutrientes.
   2. Ensaio de diferenciação
      1. Revesti uma placa de 12 com 350 µ l de proteína média (1: 100) do membrana basal matriz contendo de diferenciação. Incubar a placa a 37 ° C por 30 min e remova o meio.
      2. Placa de 200.000 células/bem no meio de diferenciação na placa matriz-revestido. Incubar as células em uma incubadora de cultura celular (37 ° C, 5% CO_2, 5% O₂) até que aderem à placa (2 h são geralmente o suficiente para as células para aderir e começar a diferenciação).
      3. Para avaliar a diferenciação, realize coloração para cadeia pesada de miosina e núcleos, como descrito anteriormente,¹¹. Alternativamente, realizar análises de imagens ao vivo, conforme descrito abaixo.

4. Live-imagem de diferenciação myoblast e rastreamento nuclear

1. Para a célula viva de imagem, colocar as células, obtido na seção 3.2.2 e banhado em uma placa de 12, sob um microscópio confocal, equipado com um sistema de incubação para manter as células a 37 ° C em 5% CO₂.
2. Use um objectivo seco 20 x (0,7 NA) para obter campos de visão com centenas de células, suficiente para monitorar a formação de miofibras. Células de H2B-GFP podem ser fotografadas com um laser de argônio da baixo-intensidade de 488 nm.
   Nota: Uma pinhole aberto garante que a profundidade da imagem (~ 10 µm) contém a espessura da célula para que as células são mantidas em foco durante todo o experimento. Usar um microscópio confocal é vantajosa desde que melhora a relação sinal-ruído das imagens, apesar de microscopia de campo amplo também poderia ser usada. Formação de miofibras pode ser monitorada através do canal de transmissão.
3. Adquira imagens de 16 bits e 1.024 x 1.024 pixels por quadro cada 6 min para 16 h. Para cada posição adquirida, gerar um arquivo de multiframe.tif (ver exemplo nos Arquivos complementares).
   Nota: No presente protocolo, software comercial, associado com o microscópio (Tabela de materiais) tem sido utilizado; Use o software adequado para alcançar o mesmo objectivo, quando usando outros microscópios.
4. Baixe o software fornecido como um arquivo suplementar. zip.
   Nota: As rotinas são scripts que devem ser executados em MATLAB. O software é uma adaptação de um software publicado¹² otimizado para o acompanhamento dos núcleos durante a formação de myotube. Este software é dividido em duas partes: a primeira que identifica os núcleos em cada quadro segmentando-os, enquanto a segunda gera "faixas" (trajetórias) do movimento de núcleos. O código completo para segmentação nuclear e um guia passo a passo para começar e acompanhamento são fornecidos em Arquivos complementares.
5. Extraia o arquivo zip e salve-o em um caminho desejado no computador pessoal (PC) em uso. Executar todas as abaixo passagens em um PC com o software necessário instalado. Observe que o arquivo. zip é composto de três pastas, como mencionado abaixo.
   Nota: Rotinas de segmentação contém as funções a ser executado para a segmentação. Rotinas de acompanhamento, em vez disso, contém as funções necessárias para o acompanhamento. Exemplo de segmentação de rastreamento fornece a base scripts e arquivos para se familiarizar com o sistema. O software usado para segmentação e acompanhamento dos núcleos é executado corretamente no MATLAB, R2015a ou versões posteriores.
6. Para segmentar os núcleos do arquivo. tif, nomeie o arquivo, por exemplo, NameFile.tif.
   1. Abra a pasta Exemplo segmentação de rastreamento e clique em DoSegmentation.m. Isto abrirá a janela de comando em MATLAB.
   2. Verifique a janela de Pasta atual à esquerda para ver todos os elementos na pasta de Exemplo de segmentação de rastreamento . Clique duas vezes em DoSegmentation.m.
      Nota: Informações detalhadas sobre as modificações que precisa ser feito no script podem ser encontradas no arquivo StepbyStep.txt. É obrigatório para modificar o script para que a variável filenameinput é NameFile.tif e folderinput é a pasta onde o arquivo. tif é contido.
   3. Execute o script (clicando no green botão executar ). O resultado da segmentação serão salvas como um file.mat (SegmentedNameFile.mat), enquanto a segmentação dos núcleos pode ser visualizada na figura a saída.
      Nota: Parâmetros para a segmentação, descrito no script, podem ser modificados, se necessário. A qualidade da segmentação pode ser verificada usando o script CheckSegmentation.m (consulte o arquivo de StepbyStep.txt). Com base nisso, se a qualidade da segmentação é pobre (apenas alguns núcleos detectados), ajustar os parâmetros da segmentação, claramente indicado no script DoSegmentation.m e repita o procedimento.
7. Para gerar as faixas (ou seja, as trajetórias de cada um dos núcleos no tempo), usar as posições nucleares obtidos na segmentação, execute o script GenerateTracks.m na mesma pasta de trabalho. Não se esqueça de adicionar o arquivo segmentação apropriada como uma entrada, obtidos antes (Veja o arquivo StepbyStep.txt para mais informações).
   Nota: Como uma saída, o usuário irá obter um arquivo de TrackedNameFile.mat, com uma matriz para os x-coordenadas e outra matriz para o y-coordenadas das faixas geradas.
8. Avaliar a qualidade das faixas usando CheckTracking.m (consulte o arquivo StepbyStep.txt para mais informações). Use a figura de saída desta última passagem para ajudar a visualizar cada posição de núcleos no tempo. Verifique no lado esquerdo para cruzes verdes que indicam cada núcleo segmentado. Para selecionar um núcleo específico, use a barra de rolagem inferior. Observe que o núcleo selecionado irá ser circulado em vermelho, enquanto à direita, a trajetória da célula selecionada pode ser seguida no tempo (usando a barra de rolagem superior).

Resultados

Para seguir automaticamente o movimento nuclear durante a diferenciação de myoblast em imagens ao vivo, os núcleos devem preferencialmente ser fluorescente etiquetados. É importante notar que usar moléculas de DNA-intercalante não é viável porque estas moléculas interferem com a proliferação e diferenciação de mioblastos primária¹³. Como exemplo, proliferação e diferenciação foram analisados em mioblastos primários cultivados com ou sem Hoechst (...

Discussão

Fibras musculares (myofibers) são células multinucleadas que são formadas pela fusão de células precursoras de músculo (mioblastos) derivada de células-tronco musculares (células satélites) que se submetem a proliferação e diferenciação^{2,3, 4}. Para avaliar a diferenciação de myoblast, o procedimento comum consiste de cultivo mioblastos em diferenciar médio e fixação das células em pontos de tempo diferentes p...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
chicken embryos extract	Seralab	CE-650-J
collagenase	Sigma	C9263-1G	125units/mg
collagen from calf skin	Sigma	C8919
dispase	Gibco	17105-041	1.78 units/mg
doxyciclin	Sigma	D1515
DMEM	Sigma	D5671
fetal bovine serum	Life technologies	10270106
gentamicin	Sigma	G1397
Horse serum	Invitrogen	16050-098
Hoechst	life technologies	33342
IMDM	Sigma	I3390
L-glutamine	Sigma	G7513
Matrigel	Corning	356231
penicillin-streptomycin	Sigma	P0781
red blood cells lysis medium	Biolegend	420301
Digestion medium
collagenase	40 mg
dispase	70 mg
PBS	20 ml
filtered 0.22um
Blocking medium
DMEM
Fetal bovine serum	10%
L-glutammine	1%
penicillin-streptomycin	1%
gentamicin	1 ‰
filtered 0.22um
proliferation medium
IMDM
Fetal bovine serum	20%
L-glutammine	1%
penicillin-streptomycin	1%
gentamicin	1 ‰
chichen embryo extract	3%
filtered 0.22um
differentiation medium
IMDM
Horse serum	2%
L-glutammine	1%
penicillin-streptomycin	1%
gentamicin	1 ‰
chichen embryo extract	1%
filtered 0.22um