ניצול הדמיה בשידור חי על המסלול גרעינים במהלך התמיינות Myoblast, פיוז'ן

Summary

בידול שרירי השלד הוא תהליך דינמי מאוד, אשר נשענת בעיקר על מיקום הגרעין. כאן, אנו מתארים שיטה כדי לעקוב אחר תנועות גרעינים על ידי הדמיה תא בשידור חי במהלך התמיינות myoblast היווצרות myotube וכדי לבצע אפיון כמותי של גרעינים dynamics על-ידי חילוץ מידע מעקב אוטומטי אחר.

Abstract

מיקום הגרעין בתוך התאים חשוב עבור תהליכים תאיים מרובים בהתפתחות והתחדשות. הדוגמה הכי מסקרן של מיצוב גרעיני מתרחשת במהלך התמיינות שרירי השלד. סיבי השריר (myofibers) הם תאים multinucleated שהוקמה על ידי היתוך גרעיני של תאי קודמן שריר (myoblasts) נגזר תאי גזע שריר (תאים הלוויין) עוברים התפשטות ובידול. מיקום הגרעין הנכונה בתוך myofibers נדרש עבור התחדשות השרירים תקין והתפקוד. ההליך נפוצות להערכת בידול myoblast היווצרות myofiber מסתמך על תאים קבוע נותחו על ידי immunofluorescence, אשר פוגעת המחקר של תנועה גרעינית והתנהגות תא לאורך זמן. כאן, אנו מתארים שיטה לניתוח של בידול myoblast היווצרות myofiber על ידי הדמיה תא חי. אנו מספקים תוכנה למעקב גרעיני אוטומטית להשיג תפוקה גבוהה אפיון כמותי של דינמיקה גרעיני והתנהגות myoblast (קרי, את המסלול) במהלך התמיינות ופיוז'ן.

Introduction

שרירי השלד הוא הרקמה הגדולה ביותר בגוף האדם, בהיקף של 35% - 40% של מסת גוף¹. תאי לוויין הם תאי גזע שריר, המאופיינת אנטומית את עמדתם (juxtaposed כדי קרום פלזמה, מתחת הנדן הבזליים של סיבי שריר), כי להצמיח myoblasts מתרבים (myogenic ובתאים), אשר בסופו של דבר להבדיל להשתלב myofibers הקיימים ו/או הפתיל טופס חדש myofibers^2,3,4. הגילוי שלהם ואת ההתקדמות בחקר הביולוגיה שלהם הוביל תובנות משמעותיות שריר התפתחות והתחדשות.

פרוטוקולים לבודד, להבדיל myoblasts לתוך myotubes פותחו לפני שנים רבות, נמצאים בשימוש נרחב עדיין ללמוד שרירי השלד בידול^5,6,7. עם זאת, רוב השיטות האלה מייצגים סטטי שגרות אשר מסתמכים על הניתוח של תאים קבוע, כתוצאה מכך, תאפשר למדענים לחקור תהליכים מאוד דינמי, כגון myoblast פיוז'ן וההתבגרות myofiber באופן מלא. הדוגמה הבולט ביותר היא מיקום הגרעין, אשר הוא, עם גרעינים בתחילה במרכז myofiber, והיא, לאחר מכן, הממוקמים בפריפריה אחרי myofiber ההבשלה^8,9. הדמיה חיה היא הטכניקה המתאימה ביותר כדי להשיג עוד תובנות תופעה מוזרה שכזו.

כאן, אנו מתארים שיטה המאפשרת מדענים להקליט בידול myoblast היווצרות myotube על ידי מיקרוסקופ זמן לשגות, כדי לבצע ניתוח כמותי החל מעקב אוטומטי של גרעינים myoblast. שיטה זו מספקת תפוקה גבוהה כמותיים אפיון של דינמיקה גרעיני והתנהגות myoblast במהלך התמיינות ופיוז'ן. הפרוטוקול מחולק לארבעה חלקים שונים, כלומר (1) אוסף של השרירים hindlimbs של עכברים, (2) בידודו של ראשי myoblasts המורכבת עיכול אנזימטי ועל מכניים, התפשטות (3) myoblast, בידול ו (4) חיים הדמיה כדי לעקוב אחר גרעינים בתוך ה 16 הראשונה של בידול myoblast.

בהליך הבא, myoblasts מבודד ויזת עבודה H2B-GFP עכברים, שטופלו µg 1/mL דוקסילין לזירוז ביטוי ויזת עבודה H2B-GFP, כפי שתואר קודם לכן¹⁰. לחלופין, זה אפשרי כדי לבודד את myoblasts של אחרים העכברים הטרנסגניים המבטאים החלבון הניאון בגרעין או כדי transfect את התאים מבודד פראי-סוג עכברים להביע את החלבון הניאון בגרעין, כפי שתואר על ידי פימנטל ואח. ⁹.

Protocol

בכל ההליכים הכרוכים בנושאים בעלי חיים אושרו על ידי סן רפאלה אכפת חיה מוסדיים ועל שימוש הוועדה.

1. ניתוח של השרירים hindlimb העכבר

1. לחטא פינצטה ומספריים (שני ישרים ועקומים) על ידי autoclaving.
2. להכין ולסנן (0.22 מיקרומטר) בכל אמצעי התקשורת (חסימה בינוני, בינוני עיכול, מתרבים בינוני, המבדילים בינוני) לפני תחילת הניסוי (ראה טבלה של חומרים).
3. לשים 5 מ ל תמיסת באגירה פוספט (PBS) 35 מ מ פטרי לאוסף שריר.
4. להקריב את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם או באמצעות CO₂ , לחטא את העור עם אתנול. הסר את העור hindlimbs ואת הגפיים העליונות באמצעות מספריים, פינצטה, כדי להקל את ניתוקה של השרירים.
   הערה: השרירים יכול להיות מבודד עכברים neonatal או למבוגרים. עכברים neonatal יש עלייה במספר תאי לוויין לעומת עכברים בוגרים. עם זאת, המספר הכולל של תאי לוויין זה יכול להיות מבודד למבוגרים עכבר אחת מספיקה לבצע את הניסוי המתואר להלן.
5. לבודד השוקתי הסוליה, השריר פושט האצבעות הארוך (EDL), הסובך, הארבע ראשי, התלת, לשים אותם בצלחת פטרי המכילות PBS. לעזוב את המנה על קרח. הסר בזהירות גידים ושומן עם פינצטה ומספריים מעוקר.

2. בידוד של myoblasts הראשי

הערה: כל נהלי תרבית תאים נעשים בתנאים סטריליים.

1. הסר את השרירים, טוב, מגניב. לחתוך, מינצ השרירים, באמצעות מספריים מעוגלים סטרילי, עד מסה אחידה, מתקבל. לשים את השרירים החלקים לתוך צינור 50 מ.
2. להוסיף 10 מ של המדיום עיכול החלקים שריר, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות תחת עצבנות חזקה (250 דקות^-1) באמבט מים, לעכל enzymatically את השרירים.
3. להוסיף 10 מיליליטר של Dulbecco שונה בינוני של הנשר (DMEM) המכיל 10% סרום שור עוברית (FBS), גלוטמין 1%, 1% פניצילין/סטרפטומיצין ו גנטמיצין 1% (חסימה בינוני) כדי לעצור את העיכול.
4. צנטריפוגה ב x 40 g למשך 5 דקות ולאסוף את תגובת שיקוע בשפופרת 50 מ. שמור את צניפה על קרח.
   הערה: לאחר צנטריפוגה, תגובת שיקוע מכיל כמה תאים הלוויין, תאי דם, תאי אנדותל ו fibroblasts, בעוד בגדר מכיל חתיכות מעוכל משרירים ורקמות. כדי להגדיל את מספר תאים בודדים, בגדר חייב להיות נתון שלבים נוספים של מערכת העיכול, כפי שמתואר להלן.
5. Centrifuge תגובת שיקוע ב x 650 גרם במשך 5 דק. להשליך את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 1 מ"ל של DMEM המכיל 10% FBS. שמור בגדר resuspended על הקרח.
6. חזור על שלבים 2 x למשך שארית בגדר שהושג בשלב 2.4 2.2 – 2.5 ולהוסיף את כדורי resuspended לאחר מכן בגדר resuspended הראשון והתפאורה על קרח.
7. עוברים את כדורי resuspended דרך מסנן מיקרומטר 70 ואז דרך פילטר מיקרומטר 40. להוסיף 15 מ"ל של DMEM עם 10% FBS, צנטריפוגה ב x 650 גרם במשך 5 דקות.
8. Resuspend בגדר תא ב- 3 מ"ל של מאגר פירוק של תאי הדם האדומים כדי לרוקן את תאי הדם האדומים. תקופת דגירה זה של 5 דקות בטמפרטורת החדר. להוסיף 40 מ של PBS להפסיק את פירוק של כדוריות דם אדומות, ואת צנטריפוגה ב 650 x גרם במשך 5 דק. הסר תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 5 מ של DMEM עם 10% FBS.
9. בשלב preplating, לוחית רישוי התאים 20 מ של התפשטות בינוני בצלחת פטרי 150 מ מ ללא ציפוי. לאחר h 1 של דגירה ב חממה תרבות התא (37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂), לאסוף את המדיום.
   הערה: Fibroblasts, הצמדת לצלחת, ואז מתבטלים, בעוד תאי לוויין להישאר ההשעיה.
10. חזור על שלב 2.9 3 x ו, בשלב preplating האחרונה, לאסוף את המדיום המכיל תאי לוויין ההשעיה.
11. צנטריפוגה ב x 650 גרם במשך 5 דקות.
12. בעוד התאים הם צריך שתוציאו, מעיל שתי צלחות פטרי 150 מ מ עם קולגן (10 מ"ל של פתרון 0.1% ב- 0.1 M חומצת חומץ). כדי לעשות זאת, לשים הקולגן בצלחת, תקופת דגירה של 5 דקות, ולהסיר אותו. תן את הצלחת יבש למשך 30 דקות.
13. למחוק את תגובת שיקוע שהושג בשלב 2.11, resuspend בגדר תא ב- 40 מ של התפשטות בינוני (טבלה של חומרים). צלחת את התאים על שתי צלחות פטרי מצופים קולגן 150 מ מ (20 מ"ל לכל מנה) ולשמור התאים חממה תרבות התא (37 מעלות צלזיוס, 5% CO_2, 5% O₂) התפשטות בינוני במשך 2-3 ימים עם 1 µg/mL דוקסילין לזירוז ביטוי ויזת עבודה H2B-GFP.
    הערה: שלב זה מאפשר ההתפשטות של myoblasts כדי לקבל מספר גדול יותר של תאים עבור עוד מבחני. תא צפיפות נשמר נמוך מאוד כדי למנוע הבחנה ספונטנית של myoblasts לתוך myotubes.

3. מבחני התפשטות ובידול Myoblast

הערה: כאשר myoblast צפיפות גבוהה, כמה תאים ליזום התארכות ולאחר מכן, יש צורך לפצל את התאים. באופן כללי, זה אפשרי לפצל תאים 2 x x-3 מבלי להשפיע על פנוטיפ שלהם.

1. למחוק את המדיום, לשטוף את התאים עם 5 מ של PBS, להוסיף 2 מ של טריפסין (1 x), דגירה לצלחת-37 מעלות צלזיוס חממה תא עבור 5 דק הסימון תחת המיקרוסקופ ואת, כאשר תאים עגולים לנתק, הוסף 5 מ של DMEM עם 10% FBS כדי להשבית את טריפסין. לספור את מספר תאים (בדרך כלל זה ניתן לקבל כ עונה 1 פרק 10⁶ תאים/עכבר...).
   הערה: הדגירה עם טריפסין עבור 5 דקות בדרך כלל מספיק לנתק את myoblasts proliferating.
2. נושא את התאים לאחד מבחני המתוארים להלן.
   1. התפשטות assay
      1. צלחת 50,000 תאים/טוב 1 מ"ל/טוב של התפשטות במדיום צלחת 12-ובכן מצופים קולגן, דגירה מצופים בתאים חממה תרבות התא (37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂). לתקן ולספור את התאים 24, 48 או 72 h.
         הערה: המדיום מוחלף כל 48 שעות כדי למנוע תשישות התזונתי.
   2. בידול assay
      1. מעיל צלחת 12-ובכן עם 350 µL של בידול בינוני המכיל קרום המרתף מטריקס (1: 100). דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ולהסיר את המדיום.
      2. צלחת 200,000 תאים/היטב במדיום בידול בצלחת מצופים מטריצה. דגירה התאים חממה תרבות התא (37 מעלות צלזיוס, 5% CO_2, 5% O₂) עד הם דבקים לצלחת (2 h הם בדרך כלל מספיק עבור התאים לדבוק וכדי להתחיל בידול).
      3. כדי להעריך בידול, לבצע צביעת שרשרת כבדה צולבות הקישור חוטים שרירן, גרעינים כמו שתואר לעיל¹¹. לחלופין, לבצע ניתוח הדמיה לחיות כפי שמתואר להלן.

4. Live-הדמיה של בידול myoblast ומעקב גרעינית

1. עבור תא חי הדמיה, לשים את התאים, שהתקבל בסעיף 3.2.2, מצופה של צלחת 12-ובכן, תחת מיקרוסקופ קונפוקלי, מאובזר עם מערכת דגירה כדי לשמור על התאים ב- 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO₂.
2. השתמש מטרה יבש 20 x (0.7 NA) כדי לקבל מבט שדות עם מאות תאים, מספיק כדי לעקוב אחר היווצרות myofiber. ויזת עבודה H2B-GFP תאים יכולים לדימות עם לייזר בעוצמה נמוכה 488 ננומטר ארגון.
   הערה: חריר פתוח מבטיח כי עומק התמונה (~ 10 מיקרומטר) מכיל את עובי התא כך תאים נשמרים בפוקוס לאורך כל הניסוי. באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי אמנם יתרון, שכן היא משפרת את יחס אות לרעש של התמונות, מיקרוסקופיית שדה רחב יכול לשמש גם. היווצרות Myofiber ניתן לנטר דרך ערוץ שידור.
3. לרכוש תמונות של 16 סיביות ו 1,024 x 1,024 פיקסלים לכל מסגרת כל 6 דקות עבור 16 h. לכל תפקיד הנרכש, ליצור קובץ multiframe.tif (ראה לדוגמה את הקבצים המשלימים).
   הערה: בפרוטוקול הנוכחי, תוכנה מסחרית הקשורים עם המיקרוסקופ (טבלה של חומרים) שימש; השתמש התוכנה המתאימה כדי להשיג את אותה המטרה, כאשר באמצעות מיקרוסקופים אחרים.
4. להוריד את התוכנה המצורפת. zip קובץ משלים.
   הערה: רוטינות הם קבצי script שיש להפעיל ב- MATLAB. התוכנה היא עיבוד של התוכנה שפורסמו¹² אופטימיזציה עבור המעקב של הגרעינים במהלך היווצרות myotube. תוכנה זו מחולקת לשני חלקים: הראשון זיהוי הגרעינים בכל מסגרת לפי הממיין אותם, בעוד השני יוצר "מסלולים" (מסלולים) תנועת גרעינים. הקוד המלא עבור פילוח גרעיני ומעקב ומדריך צעד אחר צעד על תחילת העבודה ניתנים הקבצים המשלימים.
5. לחלץ את קובץ ה-zip, לשמור אותו בנתיב הרצוי על המחשב האישי (PC) בשימוש. לבצע את כל להלן קטעים במחשב עם התוכנה הדרושה מותקן כבר. שימו לב כי קובץ ה-zip מורכב שלוש תיקיות כאמור להלן.
   הערה: פילוח רוטינות מכיל את הפונקציות להפעלה פילוח. מעקב אחר רוטינות, במקום זאת, מכיל את הפונקציות הדרושות עבור המעקב. מעקב אחר פילוח דוגמה מספק סקריפטים בסיסיים של קבצים כדי להכיר את המערכת. התוכנה פילוח והוא מעקב של הגרעינים פועל כהלכה ב- MATLAB, R2015a או גירסאות מאוחרות יותר.
6. כדי לחלק את הגרעינים מהקובץ. tif, שם הקובץ, לדוגמה, NameFile.tif.
   1. פתח את תיקיית מעקב פילוח דוגמה ולחץ על DoSegmentation.m. פעולה זו תפתח חלון הפקודה ב- MATLAB.
   2. בדוק את חלון התיקייה הנוכחית בצד שמאל כדי לראות את כל האלמנטים בתיקיה דוגמה של פילוח מעקב . לחץ פעמיים על DoSegmentation.m.
      הערה: ניתן למצוא מידע מפורט על השינויים צריכים להיעשות בקובץ ה-script בקובץ StepbyStep.txt. זה הכרחי כדי לשנות את ה-script כך משתנה filenameinput היא NameFile.tif והיא folderinput התיקיה שבה נכלל בקובץ. tif
   3. להריץ את הסקריפט (על ידי לחיצה על הירוק לחצן הפעל ). התוצאה של פילוח יישמרו של file.mat (SegmentedNameFile.mat), ואילו פילוח של הגרעינים, ניתן לאבחן באיור פלט.
      הערה: פרמטרים עבור פילוח, תיאר בקובץ ה-script, יכול להיות שונה אם יש צורך. איכות פילוח ניתן לבדוק באמצעות קובץ ה-script CheckSegmentation.m (ראה קובץ StepbyStep.txt). בהתבסס על זה, אם האיכות של פילוח עניים (רק כמה גרעינים זוהה), להתאים את הפרמטרים של פילוח, בבירור שצוין בקובץ ה-script DoSegmentation.m , וחזור על ההליך.
7. כדי להפיק את הרצועות (קרי, מסלולים של כל האטומים בזמן), באמצעות תנוחות גרעיני להשיג פילוח, להריץ את הסקריפט GenerateTracks.m לעבוד באותה תיקיה. הקפד להוסיף את הקובץ המתאים פילוח כקלט, שהושג בעבר (ראה הקובץ StepbyStep.txt למידע נוסף).
   הערה: כפלט, המשתמש יהיה להשיג קובץ TrackedNameFile.mat, עם מטריצה עבור הקואורדינטות x ובמטריצה עבור הקואורדינטות-y של המסילה שנוצר.
8. להעריך את איכות המסילות CheckTracking.m (ראה את הקובץ StepbyStep.txt למידע נוסף). להשתמש את דמותו פלט של קטע זה האחרון כדי להמחיש לכל תפקיד רב-קוטבי בזמן. בדוק בצד השמאל של צלבים ירוק המציינים כל גרעין מקוטע. כדי לבחור גרעין אחד ספציפי, השתמש בפס הגלילה נמוכה יותר. שימו לב כי הקיף את הגרעין שנבחר באדום, ואילו בצד ימין, המסלול של התא שנבחר ניתן בעקבות בזמן (באמצעות הגלילה העליון).

תוצאות

לעקוב באופן אוטומטי של גרעיני התנועה במהלך התמיינות myoblast בתחום ההדמיה בשידור חי, הגרעינים יש מעדיפים fluorescently לתייג. חשוב לציין כי באמצעות מולקולות DNA-intercalating הוא לא ריאלי כי מולקולות אלה להפריע התפשטות ובידול של ראשי myoblasts¹³. לדוגמה, התפשטות ובידול יש כבר ניתח?...

Discussion

סיבי השריר (myofibers) הם תאים multinucleated שנוצרו על ידי היתוך גרעיני של תאי שריר מבשרי (myoblasts) נגזר תאי גזע שריר (תאים הלוויין) עוברים התפשטות ובידול^{2,3, 4}. כדי להעריך myoblast בידול, ההליך משותף מורכב culturing myoblasts המבדילים בינוני ותיקון התאים בנקודות זמן ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
chicken embryos extract	Seralab	CE-650-J
collagenase	Sigma	C9263-1G	125units/mg
collagen from calf skin	Sigma	C8919
dispase	Gibco	17105-041	1.78 units/mg
doxyciclin	Sigma	D1515
DMEM	Sigma	D5671
fetal bovine serum	Life technologies	10270106
gentamicin	Sigma	G1397
Horse serum	Invitrogen	16050-098
Hoechst	life technologies	33342
IMDM	Sigma	I3390
L-glutamine	Sigma	G7513
Matrigel	Corning	356231
penicillin-streptomycin	Sigma	P0781
red blood cells lysis medium	Biolegend	420301
Digestion medium
collagenase	40 mg
dispase	70 mg
PBS	20 ml
filtered 0.22um
Blocking medium
DMEM
Fetal bovine serum	10%
L-glutammine	1%
penicillin-streptomycin	1%
gentamicin	1 ‰
filtered 0.22um
proliferation medium
IMDM
Fetal bovine serum	20%
L-glutammine	1%
penicillin-streptomycin	1%
gentamicin	1 ‰
chichen embryo extract	3%
filtered 0.22um
differentiation medium
IMDM
Horse serum	2%
L-glutammine	1%
penicillin-streptomycin	1%
gentamicin	1 ‰
chichen embryo extract	1%
filtered 0.22um