악용 Myoblast 분화와 융합 하는 동안 트랙 핵에 라이브 영상

요약

골격 근육 분화 특히 핵 위치에 의존 하는 매우 역동적인 과정 이다. 여기, 우리가 myoblast 차별화 및 myotube 형성 동안 라이브 셀 이미징에 의해 핵 움직임을 추적 하 고 자동 추적에서 정보를 추출 하 여 핵 역학의 정량적 특성 분석을 수행 하는 방법을 설명 합니다.

초록

세포 내에서 핵 위치 하는 것은 여러 세포 프로세스 개발 및 재생에 중요 합니다. 핵 위치의 가장 흥미로운 예제 골격 근육 분화 동안 발생합니다. 근육 섬유 (myofibers)는 multinucleated 세포 증식과 분화를 받 다 근육 줄기 세포 (위성 세포)에서 파생 된 근육 선구자 세포 (myoblasts)의 융합에 의해 형성. Myofibers 내에서 정확한 핵 위치 하는 것이 적절 한 근육 재생 및 기능에 대 한 필요 합니다. Myoblast 차별화와 myofiber 형성 평가 하는 일반적인 절차는 고정된 세포 면역 형광 검사, 시간이 지남에 핵 운동 및 셀 동작의 연구를 방해에 의해 분석에 의존 합니다. 여기, 라이브 셀 이미징에 의해 myoblast 차별화와 myofiber 형성의 분석 하는 방법을 설명합니다. 차별화 및 퓨전 중 핵 역동성 및 myoblast 행동 (즉, 궤적)의 높은 처리량 양적 특성을 얻기 위해 자동화 된 핵 추적에 대 한 소프트웨어를 제공 하 고.

서문

골격 근육 몸 질량¹의 35%-40%에 달하는 인체에서 가장 큰 조직 이다. 인공위성 세포는 근육 줄기 세포, 해부학 적 특징 확산 myoblasts (조직적 조상 세포)을 일으키 다, (플라즈마 막 아래 근육 섬유의 기저 lamina에 juxtaposed), 그들의 위치는 결국 차별화 및 기존 myofibers에 통합 그리고/또한 형태 새로운 myofibers^2,,34퓨즈. 그들의 발견 및 그들의 생물학 연구에서 근육 발달 및 재생에 중요 한 통찰력을 주도하 고 있다.

격리 하 고 myotubes로 myoblasts 분화 프로토콜 많은 년 전에 개발 되었습니다 하 고 골격 근육 감 별 법^5,,67공부에 아직도 널리 이용 된다. 그러나, 이러한 방법의 대부분 고정된 셀의 분석에 의존 하 고, 따라서 완전히 myoblast 퓨전 myofiber 성숙 등 매우 역동적인 과정을 탐구 하는 과학자를 허용 하지 않는 정적 프로시저를 나타냅니다. 가장 눈에 띄는 예는 단단히 통제, 처음에 myofiber의 중심 핵과 이며, 다음, myofiber 성숙^8,9후 주변에 있는 핵 위치입니다. 라이브 영상 추가 같은 독특한 현상에 대 한 통찰력을 얻을 수 가장 적합 한 기술입니다.

여기, 우리 과학자 myoblast 차별화 및 myotube 형성 시간 경과 현미경으로 기록 하 고 myoblast 핵의 자동 추적에서 정량 분석을 수행할 수 있도록 방법을 설명 합니다. 이 메서드는 차별화와 퓨전 중 핵 역동성과 myoblast 행동의 높은 처리량 양적 특성을 제공합니다. 프로토콜은 나누어 4 개의 다른 부분, 즉 (1) 컬렉션 (2) 마우스의 hindlimbs에서 근육의 기계 및 효소 소화, (3) myoblast 확산 및 감 별 법, (4)으로 구성 된 기본 myoblasts의 격리 핵 myoblast 차별화의 첫 번째 16 h 내 추적 영상 라이브.

다음 절차에서는 myoblasts H2B GFP 마우스에서 격리 되며 doxycycline H2B GFP 표현, 앞에서 설명한¹⁰유도 1 µ g/mL로 치료. 또는, 핵에서 형광 단백질을 표현 하는 다른 유전자 변형 생쥐에서 myoblasts 격리 하거나 transfect 세포 Pimentel 외에 의해 설명 된 대로, 핵에서 형광 단백질을 표현 하기 위해 야생-타입 마우스에서 분리 가능 하다. ⁹.

프로토콜

동물 주제와 관련 된 모든 절차는 산 라파엘 레 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었다.

1입니다. 마우스 hindlimb 근육의 해 부

1. 압력가 마로 소독 하 여 핀셋과가 위 (직선 및 곡선)을 소독.
2. 준비 하 고 실험을 시작 하기 전에 모든 미디어 (매체 차단, 소화 매체, 매체, 확산 및 매체 차별화) (0.22 μ m)을 필터링 ( 재료의 표참조).
3. 35 mm 페 트리 접시 근육 컬렉션에 대 한 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 5 mL를 넣어.
4. 자 궁 경부 전위 또는 CO₂ 를 사용 하 여 마우스를 희생 하 고 에탄올으로 피부를 소독. 근육의 분리를 촉진 하기 위하여가 위, 핀셋를 사용 하 여 hindlimbs 및 위 사지에서 피부를 제거 합니다.
   참고: 근육 신생아 또는 성인 쥐에서 분리 수 있습니다. 신생아 쥐 성인 쥐에 비해 위성 세포의 증가 수가 있다. 그러나, 단일 성인 마우스에서 격리 될 수 있는 위성 세포의 총 수는 아래에서 설명 하는 실험을 수행 하기 위해 충분 합니다.
5. Tibialis, soleus, 신 근 digitorum longus (EDL), gastrocnemius, 허벅지 근육, 및 삼 두 근, 분리 하 고 PBS를 포함 하는 배양 접시에 넣어. 얼음에 접시를 남겨 주세요. 힘 줄과 지방 소독된가 위, 핀셋으로 조심 스럽게 제거.

2입니다. 기본 myoblasts의 격리

참고: 메 마른 조건에서 세포 배양에 대 한 모든 절차 완료 됩니다.

1. PBS에서 근육을 제거 합니다. 고 균일 한 질량을 얻을 때까지 무 균 곡선된가 위를 사용 하 여, 근육을 말하다. 근육 조각 50 mL 튜브에 넣어.
2. 근육 조각 소화 매체의 10 mL를 추가 하 고 근육 효소 소화를 물 욕조에 강한 동요 (250 분^-1)에서 30 분 동안 37 ° C에서 품 어.
3. 10 mL Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 1% 글루타민, 1% 페니실린/스, 그리고 1 %gentamicin (차단 매체) 소화 중지를 추가 합니다.
4. 5 분 동안 40 x g 에서 centrifuge 고 50 mL 튜브에 상쾌한을 수집 합니다. 얼음에 펠 릿을 저장 합니다.
   참고: 원심, 후는 상쾌한 되어 일부 위성 세포, 혈액 세포, 내 피 세포 및 섬유 아 세포, 소화 되지 않은 근육과 결합 조직의 펠 릿 포함 됩니다. 격리 된 셀의 수를 늘리려면, 펠 릿 아래 설명 된 대로 소화의 추가 단계를 받게 해야 합니다.
5. 원심 650 x g 5 분 삭제에서 상쾌한은 상쾌한 고 10% 포함 된 DMEM의 1 mL에 펠 릿을 resuspend FBS. 얼음에 resuspended 펠 릿을 유지.
6. 2.2-2.5 단계 2.4에서에서 얻은 2 x 펠 릿의 나머지 부분에 대 한 단계를 반복 하 고 첫 번째 resuspended 펠 릿 얼음에 보존 이후 resuspended 펠 릿 추가.
7. 70 µ m 필터를 통해 그리고 40 µ m 필터를 통해 resuspended 펠 릿을 전달 합니다. 650 x g 5 분에서 10 %FBS, 및 원심 분리기 DMEM의 15 mL를 추가 합니다.
8. 붉은 혈액 세포를 고갈에 붉은 혈액 세포 세포의 용 해 버퍼의 3 mL에 셀 펠 릿을 resuspend. 실 온에서 5 분 동안 그것을 품 어. 붉은 혈액 세포의 세포를 중단 하 고 5 분 제거는 상쾌한 650 x g 에서 원심 10 %DMEM 5 ml에서는 펠 릿 resuspend PBS의 40 mL를 추가 FBS.
9. Preplating 단계로 셀 150 m m 코팅된 페 트리 접시에 확산 매체의 20 mL에 접시. (37 ° C, 5% CO₂) 셀 문화 인큐베이터에서 보육의 1 시간 후 매체를 수집 합니다.
   참고: 섬유 아 세포, 플레이트에 다음 삭제 됩니다, 위성 세포 현 탁 액에서 남아 있는 동안.
10. 2.9 3 x, preplating의 마지막 단계에서 단계를 반복, 정지에서 위성 셀을 포함 하는 매체를 수집.
11. 5 분 동안 650 x g 에서 원심 분리기.
12. 셀 centrifuging는 동안 코트 콜라겐 (10 mL의 0.1 m M 초 산의 0.1% 솔루션)과 2 개의 150 mm 접시. 이렇게 하려면 콜라겐 접시에, 5 분 동안 품 어 놓고 그것을 제거. 접시 30 분 동안 건조 하자.
13. 2.11 단계에서 얻은 상쾌한 삭제 하 고 확산 매체 (자료 테이블)의 40 mL에 셀 펠 릿 resuspend. 접시 두 콜라겐 코팅 150 mm 접시 (접시 당 20 mL)에 셀 하 고 1 µ g/mL doxycycline H2B GFP 식 유도 하의 함께 2-3 일에 대 한 확산 매체에 셀 문화 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO_2, 5% O₂) 셀 유지.
    참고:이 단계는 myoblasts 추가 분석에 대 한 셀의 높은 번호를 얻을 수의 확산을 수 있습니다. 셀 밀도 myotubes로 myoblasts의 자발적인 차별화를 피하기 위해 매우 낮은 유지 됩니다.

3. Myoblast 확산 및 감 별 법 분석

참고: myoblast 밀도 높은 경우, 일부 셀 시작 신장, 그리고, 그것은 셀을 분할 하는 데 필요한. 일반적으로, 그것은 그들의 표현 형에 영향을 주지 않고 셀 2 x-3 x를 분할 수 있습니다.

1. 매체를 폐기, PBS의 5 mL로 세포 세척, trypsin (1x)의 2 개 mL를 추가 5 분 검사 현미경에 대 한 셀 인큐베이터에서 37 ° C에서 접시를 품 어 고, 둥근 세포를 분리 하는 경우 추가 10 %DMEM 5 mL는 트립 신을 비활성화 하는 FBS. 셀의 개수 (보통 약 1 x 10⁶ 셀/마우스를 얻을 수 이다).
   참고: 5 분에 대 한 트립 신 가진 외피는 보통 proliferating myoblasts 분리 하는 충분 한.
2. 아래에서 설명 하는 분석 중 셀 제목.
   1. 확산 분석 실험
      1. 50, 000 셀/잘 1 mL/콜라겐 코팅 12-잘 접시에 확산 매체의 접시와 도금된 셀 셀 문화 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO₂)에 품 어. 해결 하 고 24, 48 또는 72 h에 셀.
         참고: 매체 양분 소모를 피하기 위해 모든 48 h 바뀝니다.
   2. 차별화 분석 결과
      1. 차별 매체 포함 하 지하실 멤브레인 매트릭스 (1: 100)의 350 µ L와 12-잘 접시 코트. 30 분 동안 37 ° C에서 접시를 품 어 고 매체를 제거 합니다.
      2. 200, 000 셀/매트릭스 코팅 접시에 차별화 매체에 잘 플레이트. 셀 셀 문화 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO_2, 5% O₂)에 품 어 그들은 접시를 준수 될 때까지 (2 h는 일반적으로 충분히 준수 하 고 분화를 시작 하는 셀에 대 한).
      3. 차별화, 평가 하려면 앞에서 설명한¹¹myosin 무 겁 사슬 및 핵 얼룩 수행 합니다. 아래 설명 된 대로 또는 라이브 이미징 분석을 수행 합니다.

4. myoblast 차별화 및 핵 추적의 라이브 영상

1. 라이브 셀 이미징에 대 한 섹션 3.2.2에서에서 얻은 5% CO₂에서 37 ° C에서 세포를 유지 하는 인큐베이션 시스템을 갖춘 공초점 현미경 12-잘 접시에서 도금 셀을 넣어.
2. 필드의 볼을 20 배 건조 목표 (0.7 없음)를 사용 하 여 셀, 충분히 myofiber 대형 모니터의 수백. H2B GFP 셀 낮은 강도 488 nm 아르곤 레이저는 몇 군데 될 수 있습니다.
   참고: 오픈 pinhole 이미지 깊이 (~ 10 µ m)에 셀 두께 포함 세포 실험을 통해 초점에 보관 되는 보장 합니다. Confocal 현미경을 사용 하 여 유리 하다는 이미지의 신호 대 잡음 비율 개선 이후 넓은 필드 현미경 사용 될 수도 있지만. Myofiber 대형 전송 채널을 통해 모니터링할 수 있습니다.
3. 프레임 16 h에 대 한 모든 6 분 당 16 비트 및 1024 x 1024 픽셀의 이미지를 취득 합니다. 각 인수 위치에 대 한 multiframe.tif 파일을 생성 ( 보조 파일에서 예를 참조).
   참고: 현재 프로토콜에서 현미경 (자료 테이블)과 관련 된 상용 소프트웨어 사용 되었습니다; 적절 한 소프트웨어를 사용 하 여 다른 현미경을 사용 하 여 같은 목표를 달성 하기 위해.
4. .Zip 파일을 보조로 제공 하는 소프트웨어를 다운로드 합니다.
   참고: 루틴은 MATLAB에서 실행 해야 하는 스크립트. 소프트웨어 게시 소프트웨어¹² myotube 형성 중 핵의 추적에 대 한 최적화의 적응 이다. 이 소프트웨어 두 부분으로 나누어져 있습니다: 첫 번째 두 번째 "트랙" (궤도) 핵 운동의 생성 하는 동안, 그들을 분할 하 여 각 프레임에 핵을 식별. 핵 세분화 및 추적 및 시작 하는 단계별 가이드에 대 한 전체 코드는 보조 파일에 제공 됩니다.
5. Zip 파일을 추출 하 고 사용에 개인용 컴퓨터 (PC)에서 원하는 경로에 저장 합니다. 모든 수행에 필요한 소프트웨어가 이미 설치 된 PC에 구절 아래. Note로 아래에 언급 된 세 폴더의.zip 파일 구성.
   참고: 분할 루틴 함수는 세분화에 대 한 실행 수를 포함 합니다. 추적 루틴, 대신, 추적에 필요한 기능을 포함 합니다. 예 세그먼테이션 추적 기본 스크립트 및 파일 시스템에 익숙해질을 제공 합니다. 소프트웨어 사용 세분화 되 고 핵의 추적 MATLAB, R2015a 또는 이후 버전에서 제대로 실행 됩니다.
6. .Tif 파일에서 핵 세그먼트, 예를 들어 NameFile.tif파일을 이름을 지정 합니다.
   1. 예 세그먼테이션 추적 폴더를 열고 DoSegmentation.m를 클릭 합니다. 이 MATLAB에 명령 창이 열립니다.
   2. 예 세그먼테이션 추적 폴더의 모든 요소를 보고 왼쪽에 현재 폴더 창을 확인 합니다. DoSegmentation.m두 번 클릭.
      참고: 스크립트에서 할 수 있는 수정에 대 한 자세한 정보는 StepbyStep.txt 파일에서 찾을 수 있습니다. 그것은 변수 filenameinput 은 NameFile.tif 와 folderinput 는.tif 파일이 포함 된 폴더는 스크립트 수정 필수입니다.
   3. 스크립트 실행 (녹색에 클릭 하 여 실행 버튼). 핵의 분할 출력 그림에 구상 될 수 있다 하는 동안 세분화의 결과 file.mat (SegmentedNameFile.mat)로 저장 됩니다.
      참고: 필요한 경우 스크립트에 설명 된 세그먼트에 대 한 매개 변수를 수정할 수 있습니다. CheckSegmentation.m 스크립트를 사용 하 여 세분화의 품질을 확인할 수 있습니다 (StepbyStep.txt 파일을 참조). 세그먼트화의 품질은 저하 하는 경우,이에 따라 (단 몇 가지 핵 감지), 명확 하 게 DoSegmentation.m 스크립트에 표시 된 세분화의 매개 변수를 조정 하 고 절차를 반복 합니다.
7. (즉, 각 시간에 핵의 궤적) 트랙을 생성 하려면 동일한 작업 폴더에 GenerateTracks.m 스크립트를 실행 세그먼트에서 얻은 핵 위치를 사용 하 여. 적절 한 분할 파일을 입력으로 추가 하십시오 (자세한 내용은 StepbyStep.txt 파일 참조) 전에 취득.
   참고: 사용자는 출력으로 x-좌표에 대 한 매트릭스와 생성 된 트랙의 y 좌표에 대 한 또 다른 매트릭스 파일 TrackedNameFile.mat를 얻을 것 이다.
8. CheckTracking.m 를 사용 하 여 트랙의 품질을 평가 (자세한 내용은 StepbyStep.txt 파일을 참조). 이 마지막 대목의 출력 그림을 사용 하 여 시간에 각 핵 위치를 시각화 하는 데 도움이. 각 세그먼트 핵을 나타내는 녹색 십자가 대 한 왼쪽에 확인 하십시오. 하나의 특정 핵을 선택 아래 스크롤 막대를 사용 합니다. 선택 된 핵 원으로 표시 됩니다 참고 빨간색, 오른쪽에 선택된 된 셀의 궤적 지켜질 수 있다 시간에서 (사용 하 여 위쪽 스크롤 막대).

결과

자동으로 myoblast 차별화 라이브 영상에서 중 핵 움직임을 따라, 핵 우선적으로 표시 되어야 합니다 놓여있는지. Intercalating DNA 분자를 사용 하는 가능한 이러한 분자 확산과 기본 myoblasts¹³의 방해 때문에 중요 하다. 예를 들어, 확산 및 감 별 법 또는 Hoechst (그림 1) 없이 교양 기본 myoblasts에서 분석 되었습니다 했습니다. 확산 (

토론

근육 섬유 (myofibers)는 multinucleated 세포 확산 그리고 감 별 법^2,3,^{를 받아야 근육 줄기 세포 (위성 세포)에서 파생 된 근육 선구자 세포 (myoblasts)의 융합에 의해 형성 되는 4}. Myoblast 차별화를 평가 하기 위해 일반적인 절차 myoblasts 매체를 차별화 하 고 MyHC, 차별화, 마커 및의 얼룩에 얼룩이 면역 형광 검사를 수행 하기 위해 다른 시...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
chicken embryos extract	Seralab	CE-650-J
collagenase	Sigma	C9263-1G	125units/mg
collagen from calf skin	Sigma	C8919
dispase	Gibco	17105-041	1.78 units/mg
doxyciclin	Sigma	D1515
DMEM	Sigma	D5671
fetal bovine serum	Life technologies	10270106
gentamicin	Sigma	G1397
Horse serum	Invitrogen	16050-098
Hoechst	life technologies	33342
IMDM	Sigma	I3390
L-glutamine	Sigma	G7513
Matrigel	Corning	356231
penicillin-streptomycin	Sigma	P0781
red blood cells lysis medium	Biolegend	420301
Digestion medium
collagenase	40 mg
dispase	70 mg
PBS	20 ml
filtered 0.22um
Blocking medium
DMEM
Fetal bovine serum	10%
L-glutammine	1%
penicillin-streptomycin	1%
gentamicin	1 ‰
filtered 0.22um
proliferation medium
IMDM
Fetal bovine serum	20%
L-glutammine	1%
penicillin-streptomycin	1%
gentamicin	1 ‰
chichen embryo extract	3%
filtered 0.22um
differentiation medium
IMDM
Horse serum	2%
L-glutammine	1%
penicillin-streptomycin	1%
gentamicin	1 ‰
chichen embryo extract	1%
filtered 0.22um