Использование живых изображений для ядер трек во время Myoblast дифференциация и фьюжн

Резюме

Очень динамичный процесс, который особенно зависит от ядерной позиционирования является дифференциация скелетных мышц. Здесь мы описываем метод для выполнения количественная характеристика динамики ядер путем извлечения информации из автоматического отслеживания и отслеживания движения ядер у Вообразимый живой клетки во время формирования дифференциации и myotube myoblast.

Аннотация

Ядерные позиционирование внутри клетки имеет важное значение для нескольких клеточных процессов развития и регенерации. Наиболее интригующим примером ядерной позиционирования происходит во время дифференциация скелетных мышц. Многоядерные клетки, сформирована сплавливанием мышечных клеток-предшественников (миобластов) производные от мышечных стволовых клеток (Спутниковое клетки), которые проходят пролиферации и дифференцировки мышечных волокон (myofibers). Правильное позиционирование ядерных в myofibers требуется для надлежащего мышечной регенерации и функции. Общие процедуры для оценки формирования дифференциации и myofiber myoblast опирается на фиксированные клетки анализируемой иммунофлюоресценции, который препятствует изучение поведения ядерных движения и клеток со временем. Здесь мы описываем метод для анализа myoblast дифференциация и myofiber формирования на живых клеток. Мы предоставляем программное обеспечение для автоматизированной ядерный отслеживания для получения количественной характеристики высок объём ядерного динамики и myoblast поведения (т.е. траектории) во время дифференциация и фьюжн.

Введение

Скелетных мышц является крупнейшим ткани в организме человека, на сумму 35% - 40% массы тела¹. Спутниковое клетки являются мышечных стволовых клеток, анатомически характеризуется их позицию (juxtaposed на плазматической мембране, под базальной пластинки мышечных волокон), дают основания для пролиферирующих сомитов (миогенных прогениторных клеток), который в конечном итоге дифференцировать и интегрировать в существующие myofibers и/или предохранитель в форме новых myofibers^2,3,4. Их открытие и прогресс в изучении их биологии привело к значительным понимание развития мышц и регенерации.

Протоколы изоляции и дифференцировать сомитов в myotubes были разработаны много лет назад и до сих пор широко используются для изучения скелетных мышц дифференциация^5,6,7. Однако большинство этих методов представляют собой статические процедур, которые полагаются на анализ фиксированных клеток и, следовательно, не позволяют ученым в полной мере изучить весьма динамических процессов, таких как слияние myoblast и myofiber созревания. Наиболее ярким примером является ядерная позиционирования, которая жестко регулируется, с ядрами первоначально в центре myofiber и, затем, расположенных на периферии после myofiber созревания^8,9. Живой изображений является наиболее приемлемый метод для получения дальнейших понимание такой своеобразный феномен.

Здесь мы описываем метод, который позволяет ученым для записи myoblast дифференциация и myotube формирования покадровой микроскопии и выполнить количественный анализ от автоматического отслеживания myoblast ядер. Этот метод обеспечивает высок объём количественной характеристики ядерной динамики и myoblast поведения во время дифференциация и фьюжн. Протокол разделен на четыре части, а именно: (1) коллекции мышц от гомотерия мышей, (2) изоляции первичных сомитов, которая состоит в механических и ферментативного пищеварения, (3) myoblast распространения и дифференциации и (4) живой изображений для отслеживания ядер в течение первых 16 h myoblast дифференцировки.

В следующей процедуре сомитов изолированы от мышей H2B-GFP и относились с 1 мкг/мл доксициклин побудить H2B-GFP выражение, как описано выше¹⁰. В качестве альтернативы можно изолировать сомитов от других трансгенных мышей, которые выражают флуоресцентный белок в ядре или transfect клетки, изолированные от мышей дикого типа выразить флуоресцентный белок в ядре, как описано в Пиментел и др. ⁹.

протокол

Все процедуры с участием животных темы были утверждены San Raffaele институциональных животное уход и использование Комитета.

1. препарирование мыши задних конечностей мышцы

1. Стерилизуйте пинцета и ножницы (прямые и изогнутые) путем автоклавирования.
2. Подготовить и фильтрации (0,22 мкм) все СМИ (блокирующий среднего, средний пищеварение, пролиферирующих среднего и дифференциации среднего) перед началом эксперимента (см. Таблицу материалы).
3. Поставьте 5 мл физиологического раствора фосфатного буфера (PBS) в 35 мм Петри для мышц коллекции.
4. Пожертвовать мыши шейки матки вывих или с помощью CO₂ и стерилизации кожи с этанолом. Удалите кожу от гомотерия и верхних конечностей, используя ножницы и щипчики, для содействия изоляции мышц.
   Примечание: Мышцы могут быть изолированы от новорожденных и взрослых мышей. Новорожденных мышей имеют большее количество клеток Спутниковое, по сравнению с взрослых мышей. Однако общее количество Спутниковое клеток, которые могут быть изолированы от одной взрослой мыши достаточно для выполнения эксперимента, описанные ниже.
5. Изолировать tibialis, камбаловидной, Лонг разгибатель пальцев (EDL), икроножной мышцы, четырехглавая мышца и трицепсы и положил их в Петри, содержащие PBS. Оставьте блюдо на льду. Осторожно удалите сухожилия и жира с стерилизованные ножницы и щипчики.

2. изоляция первичного миобластов

Примечание: Все процедуры для клеточной культуры производятся в стерильных условиях.

1. Удаление мышцы от PBS. Вырезать и фарш мышц, с помощью стерильных изогнутые ножницы, до получения однородной массы. Положите кусочки мышц в 50 мл трубки.
2. Добавить 10 мл среды, пищеварение в части мышц и инкубировать при 37 ° C за 30 мин под сильное возбуждение (250 мин^-1) на водяной бане, ферментативно переваривать мышцы.
3. Добавьте 10 мл Дульбекко изменение орла носитель (DMEM) содержит 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), 1% глютамина, пенициллин/стрептомицина 1% и 1% гентамицин (блокирующий средний) остановить пищеварение.
4. Центрифуга на 40 x g 5 мин и собирать супернатант в 50 мл трубки. Сохраните гранул на льду.
   Примечание: После центрифугирования, супернатанта содержит некоторые Спутниковое клетки, клетки крови, эндотелиальных клеток и фибробластов, а гранулы кусочки непереваренной мышц и соединительной ткани. Чтобы увеличить количество изолированных клеток, гранулы должны подвергаться дополнительные шаги пищеварения, как описано ниже.
5. Центрифуга супернатант в 650 x g для 5 минут удалить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 1 мл DMEM, содержащие 10% FBS. Держите ресуспензированы гранул на льду.
6. Повторите шаги 2 x для остальной части гранулы, полученные на шаге 2.4 2.2-2.5 и добавьте впоследствии ресуспензированы гранулы первого ресуспензированы Пелле, сохраняется на льду.
7. Пройти ресуспензированы гранул, через 70 мкм фильтр, а затем через фильтр 40 мкм. Добавьте 15 мл DMEM с 10% FBS и центрифуги на 650 x g за 5 мин.
8. Ресуспензируйте Пелле клеток в 3 мл буфера lysis красных кровяных клеток, разрушают красные кровяные клетки. Инкубируйте 5 мин при комнатной температуре. Добавьте 40 мл PBS остановить lysis красных кровяных клеток и центрифуги на 650 x g для 5 минут удалить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 5 мл DMEM с 10% FBS.
9. Как preplating шаг плиты клетки в 20 мл среды распространения в 150 мм немелованной Петри. После 1 ч инкубации в инкубатор культуры клеток (37 ° C, 5% CO₂) собирайте средства.
   Примечание: Фибробласты, которые присоединение к пластине, затем отбрасываются, а спутниковое клетки остаются в суспензии.
10. Повторите шаг 3, 2,9 x и на последнем шаге preplating, собирать носителя, который содержит Спутниковое клеток в суспензии.
11. Центрифуга на 650 x g за 5 мин.
12. В то время как клетки центрифугирование, пальто два Петри 150 мм с коллагеном (10 мл 0,1% раствора уксусной кислоты 0,1 М). Чтобы сделать это, положить коллагена на тарелку, инкубировать на 5 мин и удалить его. Пусть пластину высохнуть в течение 30 мин.
13. Отменить супернатанта, полученного на шаге 2.11 и Ресуспензируйте Пелле клеток в 40 мл среды распространения (Таблица материалов). Пластина клетки на две чашки Петри коллаген покрытием 150 мм (20 мл на блюдо) и сохранить клетки в инкубатор культуры клеток (37 ° C, 5% CO_2, 5% O₂) в среде распространения на 2-3 дней с 1 мкг/мл доксициклин побудить H2B-GFP выражение.
    Примечание: Этот шаг позволяет распространение сомитов получить большее количество ячеек для дальнейших анализов. Плотность ячеек сохраняется очень низкий, чтобы избежать спонтанное дифференцировка сомитов на myotubes.

3. Myoblast пролиферации и дифференцировки анализов

Примечание: При высокой плотности myoblast, некоторые клетки инициировать удлинение, и затем, надо разбить ячейки. Как правило это можно разделить ячейки 2 x-3 x не затрагивая их фенотип.

1. Отказаться от среднего, вымыть клетки с 5 мл PBS, добавить 2 мл трипсина (1 x) и инкубировать пластины при 37 ° C в ячейке инкубатор для 5 минут проверить под микроскопом и когда круглых клеток отсоединить, добавить 5 мл DMEM с 10% FBS для инактивации трипсина. Подсчитать количество ячеек (обычно это можно получить около 1 х 10⁶ клеток/мышь).
   Примечание: Инкубации с трипсином за 5 мин, как правило, достаточно отсоединить пролиферирующих сомитов.
2. Тема клетки к одному из анализов, описанные ниже.
   1. Распространения пробирного
      1. Пластина 50 000 клеток/колодец в 1 мл/хорошо среды распространения в пластине 12-ну коллаген покрытием и инкубировать покрытием клетки в инкубатор культуры клеток (37 ° C, 5% CO₂). Исправить и подсчитать количество ячеек на 24, 48 или 72 ч.
         Примечание: Средство заменяется каждые 48 ч чтобы избежать истощения питательных веществ.
   2. Дифференциация пробирного
      1. Покройте 12-ну плита с 350 мкл дифференциации среднего содержащие базальной мембраны матрицы (1: 100). Инкубировать пластины при 37 ° C за 30 минут и удалите среды.
      2. Плита 200 000 клеток/хорошо в среде дифференциации в пластину матрица покрытием. Инкубировать клетки в инкубатор культуры клеток (37 ° C, 5% CO_2, 5% O₂) до тех пор, пока они придерживаются к пластине (2 h, как правило, достаточно для ячеек присоединиться и начать дифференциации).
      3. Чтобы оценить дифференциации, выполняют пятная для тяжелой цепи миозина и ядер как описано¹¹. Кроме того выполните анализ жить изображений, как описано ниже.

4. Live изображений myoblast дифференциации и ядерной отслеживания

1. Для живых клеток изображений, положить клетки, полученные в разделе 3.2.2 и покрытием в 12-ну плиты, под конфокального микроскопа, оснащенного системой инкубации для поддержания клеток при 37 ° C в 5% CO₂.
2. Используйте сухой цель 20 x (0,7 NA) для получения поля зрения с сотнями клеток, достаточно для мониторинга myofiber формирования. H2B-GFP клетки могут отражаться с низкой интенсивности 488 нм Аргонового лазера.
   Примечание: Открытые обскуры гарантирует, что изображение глубины (~ 10 мкм) содержит толщина клетки так, что клетки находятся в центре внимания на протяжении всего эксперимента. С помощью конфокального микроскопа выгодно так как она улучшает отношение сигнал шум изображения, хотя микроскопия поля также могут быть использованы. Myofiber формирования может отслеживаться через канал передачи.
3. Получение изображений 16-бит и 1 024 x 1 024 пикселей на кадр каждые 6 мин на 16 h. Для каждого приобретенного положения, создайте файл multiframe.tif (см. пример в Дополнительных файлов).
   Примечание: В настоящем Протоколе, использовалась коммерческого программного обеспечения, связанные с микроскопом (Таблица материалов); Используйте соответствующее программное обеспечение для достижения той же цели при использовании других микроскопы.
4. Скачайте программное обеспечение, предоставляемое в ZIP-файл дополнительного файла.
   Примечание: Процедуры являются сценарии, которые должны быть запущены в MATLAB. Программное обеспечение является адаптация опубликованные программы¹² , оптимизированный для отслеживания ядра во время формирования myotube. Это программное обеспечение делится на две части: первая идентифицирует ядер в каждом кадре, разбив их, в то время как вторая создает «дорожки» (траектории) движения ядер. Полный код для ядерной сегментации и отслеживания и пошаговое руководство по началу работы предоставляются Дополнительные файлы.
5. Извлеките zip-файл и сохраните его в желаемый путь на персональном компьютере (PC) в использовании. Выполнить все ниже проходы на ПК с необходимое программное обеспечение уже установлено. Обратите внимание, что ZIP-файл состоит из трех папок, как указано ниже.
   Примечание: Сегментация подпрограмм содержит функции для запуска для сегментации. Процедуры отслеживания, напротив, содержит функции, необходимые для отслеживания. Пример сегментации отслеживания обеспечивает основные сценарии и файлы познакомиться с системой. Программное обеспечение для сегментации и отслеживания ядер работает должным образом в MATLAB, R2015a или более поздних версий.
6. Для сегментирования ядра от TIF-файл, имя файла, например, NameFile.tif.
   1. Откройте папку Пример сегментации слежения и нажмите на DoSegmentation.m. Это откроет окно команд в MATLAB.
   2. Проверьте окно Текущей папке слева, чтобы просмотреть все элементы в папке Пример сегментации, отслеживания . Дважды щелкните на DoSegmentation.m.
      Примечание: Подробная информация о модификации, которые должны быть сделаны в сценарий можно найти в файле StepbyStep.txt. Это обязательно изменить сценарий, чтобы переменная filenameinput является NameFile.tif и folderinput — это папка, где содержится файл .tif.
   3. Запустите сценарий (нажав на зеленый кнопку Run ). Результат сегментации будет сохранен как file.mat (SegmentedNameFile.mat), в то время как сегментация ядра могут быть визуализированы на рисунке вывода.
      Примечание: Параметры сегментации, описанной в сценарии, могут быть изменены, в случае необходимости. Качество сегментации может проверяться с помощью скрипта CheckSegmentation.m (см. файл StepbyStep.txt). Основываясь на этом, если плохое качество сегментации (только несколько ядер обнаружен), настройте параметры сегментации, четко указано в DoSegmentation.m сценарий и повторите процедуру.
7. Для создания треков (т.е., траекторий каждого из ядер в времени), использование ядерной позиции полученные в сегментации, запустите сценарий GenerateTracks.m в той же рабочей папке. Не забудьте добавить файл правильной сегментации качестве входных данных, полученных до (см. файл StepbyStep.txt для получения дополнительной информации).
   Примечание: Как выход, пользователь получит файл TrackedNameFile.mat, с матрицы для координат x и другой для y координат создаваемого треков.
8. Оценить качество треков с помощью CheckTracking.m (см. файл StepbyStep.txt для получения дополнительной информации). Используйте рисунок вывода этого последнего прохода, чтобы помочь визуализировать позиции каждого ядра во времени. Проверить на левой стороне для зеленых крестов, которые указывают на каждом сегментированные ядра. Чтобы выбрать один из конкретных ядро, используйте нижней полосы прокрутки. Обратите внимание, что выбранный ядра будет кружил в красный цвет, в то время как на правом, траектории выбранной ячейки может следовать во времени (с помощью верхней полосы прокрутки).

Результаты

Автоматически следовать ядерной движение во время myoblast дифференциация в живых изображений, ядра должны преференциально дневно обозначаться. Важно отметить, что использование молекулы ДНК, интеркалирующие невозможно потому, что эти молекулы вмешиваться в пролиферац...

Обсуждение

Мышечных волокон (myofibers) являются многоядерные клетки, которые образуются сплавливанием прекурсоров мышечных клеток (миобластов) производные от мышечных стволовых клеток (Спутниковое клетки), которые проходят пролиферации и дифференцировки^2,-^3,

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
chicken embryos extract	Seralab	CE-650-J
collagenase	Sigma	C9263-1G	125units/mg
collagen from calf skin	Sigma	C8919
dispase	Gibco	17105-041	1.78 units/mg
doxyciclin	Sigma	D1515
DMEM	Sigma	D5671
fetal bovine serum	Life technologies	10270106
gentamicin	Sigma	G1397
Horse serum	Invitrogen	16050-098
Hoechst	life technologies	33342
IMDM	Sigma	I3390
L-glutamine	Sigma	G7513
Matrigel	Corning	356231
penicillin-streptomycin	Sigma	P0781
red blood cells lysis medium	Biolegend	420301
Digestion medium
collagenase	40 mg
dispase	70 mg
PBS	20 ml
filtered 0.22um
Blocking medium
DMEM
Fetal bovine serum	10%
L-glutammine	1%
penicillin-streptomycin	1%
gentamicin	1 ‰
filtered 0.22um
proliferation medium
IMDM
Fetal bovine serum	20%
L-glutammine	1%
penicillin-streptomycin	1%
gentamicin	1 ‰
chichen embryo extract	3%
filtered 0.22um
differentiation medium
IMDM
Horse serum	2%
L-glutammine	1%
penicillin-streptomycin	1%
gentamicin	1 ‰
chichen embryo extract	1%
filtered 0.22um