Sfruttando Live Imaging ai Nuclei di pista durante il differenziamento dei mioblasti e Fusion

Riepilogo

Differenziazione del muscolo scheletrico è un processo altamente dinamico, che in particolare si basa sul posizionamento nucleare. Qui, descriviamo un metodo per tracciare i movimenti di nuclei da formazione immagine di tensione delle cellule durante la formazione di differenziazione e miotubi dei mioblasti ed effettuare una caratterizzazione quantitativa delle dinamiche di nuclei di estrazione di informazioni da inseguimento automatico.

Abstract

Nucleare di posizionamento all'interno delle cellule è importante per molteplici processi cellulari, nello sviluppo e rigenerazione. L'esempio più intrigante di posizionamento nucleare si verifica durante la differenziazione del muscolo scheletrico. Fibre muscolari (myofibers) sono cellule multinucleated formate dalla fusione delle cellule del precursore di muscolo (mioblasti) derivati da cellule staminali del muscolo (cellule satelliti) che subiscono la proliferazione e la differenziazione. Corretto posizionamento nucleare all'interno di miofibre è richiesto per la rigenerazione muscolare adeguata e la funzione. La procedura comune per valutare la formazione di differenziazione e myofiber dei mioblasti si basa su celle fisse analizzate mediante immunofluorescenza, che ostacola lo studio del comportamento delle cellule e del movimento nucleare nel corso del tempo. Qui, descriviamo un metodo per l'analisi della formazione di differenziazione e myofiber dei mioblasti da formazione immagine di cellule vive. Mettiamo a disposizione un software per il rilevamento automatizzato ottenere una caratterizzazione quantitativa ad alta produttività delle dinamiche nucleare e comportamento dei mioblasti (vale a dire, la traiettoria) durante la differenziazione e la fusione nucleare.

Introduzione

Il muscolo scheletrico è il tessuto più grande del corpo umano, per un totale di 35% - 40% della massa del corpo¹. Le cellule satelliti sono cellule staminali del muscolo, anatomicamente caratterizzate dalla loro posizione (giustapposti alla membrana del plasma, sotto la lamina basale delle fibre muscolari), che danno origine ai mioblasti proliferanti (cellule progenitrici miogenico), che alla fine differenziare e integrare nelle miofibre esistenti e/o fusibile per formare nuove miofibre^2,3,4. La loro scoperta e i progressi nello studio della loro biologia ha portato a significativi approfondimenti lo sviluppo muscolare e la rigenerazione.

Protocolli per isolare e differenziare i mioblasti in miotubi sono stati sviluppati molti anni fa e sono ancora ampiamente utilizzati per lo studio del muscolo scheletrico differenziazione^5,6,7. Tuttavia, la maggior parte di questi metodi rappresentano procedure statiche che si basano sull'analisi delle celle fisse e, di conseguenza, non consentono agli scienziati di esplorare pienamente processi altamente dinamici, come fusione dei mioblasti e maturazione miofibre. L'esempio più eclatante è il posizionamento del nucleare, che è strettamente regolata, con nuclei inizialmente nel centro della myofiber e, quindi, situata alla periferia dopo miofibre maturazione^8,9. La formazione immagine dal vivo è la tecnica più appropriata per ottenere ulteriori approfondimenti tale fenomeno peculiare.

Qui, descriviamo un metodo che consente agli scienziati di registrare dei mioblasti differenziazione e miotubi formazione da microscopia time-lapse e per eseguire analisi quantitative dall'inseguimento automatico dei nuclei dei mioblasti. Questo metodo fornisce una caratterizzazione quantitativa ad alta produttività delle nucleare dinamiche e dei mioblasti comportamento durante la differenziazione e la fusione. Il protocollo è diviso in quattro parti, vale a dire (1) l'insieme di muscoli dalle zampe posteriori di topi, (2) l'isolamento di mioblasti primari che consiste nella digestione meccanica ed enzimatica, (3) dei mioblasti proliferazione e differenziazione e (4) live imaging per tenere traccia di nuclei all'interno le prime 16 ore di differenziamento dei mioblasti.

Nella procedura seguente, mioblasti sono isolate da topi H2B-GFP e trattati con 1 µ g/mL di doxiciclina per indurre l'espressione di H2B-GFP, come descritto in precedenza¹⁰. In alternativa, è possibile isolare i mioblasti da altri topi transgenici che esprimono una proteina fluorescente nel nucleo o a transfect le cellule isolate da topi wild-type per esprimere una proteina fluorescente nel nucleo, come descritto da Pimentel et al. ⁹.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dal comitato di uso e San Raffaele istituzionale Animal Care.

1. dissezione dei muscoli hindlimb del mouse

1. Sterilizzare in autoclave pinzette e forbici (sia dritti e curve).
2. Preparare e filtro (0,22 µm) tutti i media (blocco medio, digestione medio, medio di proliferazione e differenziazione medio) prima di iniziare l'esperimento (Vedi Tabella materiali).
3. Mettere 5 mL di tampone fosfato salino (PBS) in una capsula di Petri per la raccolta del muscolo da 35 mm.
4. Sacrificare il mouse dislocazione cervicale o usando CO₂ e sterilizzare la pelle con etanolo. Togliere la pelle dalle zampe posteriori e arti superiori utilizzando forbici e pinzette, per facilitare l'isolamento dei muscoli.
   Nota: I muscoli possono essere isolati da topi neonatali o adulti. Topi neonatali hanno un numero aumentato di cellule satelliti rispetto ai topi adulti. Tuttavia, il numero totale di cellule satelliti che possono essere isolate da un topo adulto singolo è sufficiente per eseguire l'esperimento descritto di seguito.
5. Isolare tibialis, Soleo, longus di digitorum dell'estensore (EDL), gastrocnemio, quadricipiti e tricipiti e metterli nel piatto Petri contenente PBS. Lasciare il piatto sul ghiaccio. Rimuovere con cura i tendini e grasso con forbici sterilizzate e pinzette.

2. isolamento di mioblasti primari

Nota: Tutte le procedure per la coltura cellulare avviene in condizioni di sterilità.

1. Rimuovere i muscoli da PBS. Tagliare e sminuzzare i muscoli, utilizzando forbici curve sterile, fino ad ottenga una massa omogenea. Mettere i pezzi di muscolo in un tubo da 50 mL.
2. Aggiungere 10 mL di terreno di digestione per i pezzi di muscolo e incubare a 37 ° C per 30 min sotto forte agitazione (250 min^-1) in un bagno di acqua, per digerire enzimaticamente i muscoli.
3. Aggiungere 10 mL di Dulbecco per volta mezzo di Eagle (DMEM) contenente 10% siero bovino fetale (FBS), la glutamina 1%, 1% di penicillina/streptomicina e gentamicina 1% (blocco medio) per interrompere la digestione.
4. Centrifugare a 40 x g per 5 min e raccogliere il surnatante in una provetta da 50 mL. Salvare il pellet sul ghiaccio.
   Nota: Dopo la centrifugazione, il sovranatante contiene alcune cellule satelliti, cellule del sangue, cellule endoteliali e fibroblasti, mentre il pellet contiene pezzi di muscolo non digerito e tessuto connettivo. Per aumentare il numero di cellule isolate, il pellet dovrà essere sottoposti a ulteriori passaggi di digestione come descritto di seguito.
5. Centrifugare il supernatante a 650 x g per 5 min, scartare il supernatante e risospendere il pellet in 1 mL di DMEM contenente 10% FBS. Mantenere il sedimento risospeso sul ghiaccio.
6. Ripetere i passaggi da 2.2 – 2,5 x 2 per il resto del precipitato ottenuto nel passaggio 2.4 e aggiungere i pellet successivamente sedimento sedimento risospeso prima conservato sul ghiaccio.
7. Passare i pellet sedimento attraverso un filtro di 70 µm e poi attraverso un filtro a 40 µm. Aggiungere 15 mL di DMEM con 10% FBS e centrifugare a 650 x g per 5 min.
8. Risospendere il pellet cellulare in 3 mL di tampone di lisi delle cellule di anima rosse per vuotare i globuli rossi. Incubare per 5 min a temperatura ambiente. Aggiungere 40 mL di PBS per fermare la lisi dei globuli rossi e centrifugare a 650 x g per 5 min, rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in 5 mL di DMEM con 10% FBS.
9. Come passo preplating, piastra le cellule in 20 mL di terreno di proliferazione in una capsula Petri 150 mm non patinata. Dopo 1 h di incubazione in un'incubatrice di coltura cellulare (37 ° C, 5% CO₂), raccogliere il mezzo.
   Nota: Fibroblasti, collegamento alla piastra, quindi vengono eliminati, mentre le cellule satelliti rimangono in sospensione.
10. Ripetere il passaggio 2,9 3 x e, nell'ultima fase preplating, raccogliere il mezzo che contiene le cellule satelliti in sospensione.
11. Centrifuga a 650 x g per 5 min.
12. Mentre le cellule sono centrifugazione, cappotto due capsule di Petri 150mm con collagene (10 mL di soluzione 0,1% in acido acetico 0,1 M). Per farlo, mettere il collagene sulla piastra, incubare per 5 minuti e rimuoverlo. Asciugare la piastra per 30 min.
13. Scartare il sopranatante ottenuto nel passaggio 2.11 e risospendere il pellet cellulare in 40 mL di terreno di proliferazione (Tabella materiali). Piastra le cellule su due capsule di Petri rivestite con collagene 150 mm (20 mL per ogni piatto) e mantenere le cellule in un'incubatrice di coltura cellulare (37 ° C, 5% CO_2, 5% O₂) nel terreno di proliferazione per 2 – 3 giorni con 1 µ g/mL di doxiciclina per indurre l'espressione di H2B-GFP.
    Nota: Questo passaggio consente la proliferazione dei mioblasti per ottenere un numero maggiore di cellule per ulteriori analisi. Densità delle cellule viene mantenuta molto bassa per evitare una spontanea differenziazione dei mioblasti in miotubi.

3. dei mioblasti saggi di proliferazione e differenziazione

Nota: Quando la densità dei mioblasti è alta, alcune cellule avviare allungamento, e quindi, è necessario dividere le celle. In genere, è possibile dividere celle 2 x-3 x senza intaccare il loro fenotipo.

1. Eliminare il prodotto, lavare le cellule con 5 mL di PBS, aggiungere 2 mL di tripsina (1x) e incubare la piastra a 37 ° C in un'incubatrice di cellulare per 5 min. Check sotto il microscopio e, quando cellule rotonde scollegare, aggiungere 5 mL di DMEM con 10% FBS per inattivare la tripsina. Contare il numero di cellule (di solito è possibile ottenere circa 1 x 10⁶ cellule/del mouse).
   Nota: L'incubazione con tripsina per 5 min è in genere sufficiente per staccare i mioblasti proliferanti.
2. Sottoporre le cellule a uno dei saggi descritti di seguito.
   1. Analisi di proliferazione
      1. Piastra di 50.000 cellule/pozzetto in 1ml/bene di medie di proliferazione in un piatto di 12-pozzetti rivestite con collagene e incubare le cellule placcate in un'incubatrice di coltura cellulare (37 ° C, 5% CO₂). Difficoltà e contare le celle a 24, 48 o 72 ore.
         Nota: Il mezzo è sostituito ogni 48 h per evitare l'esaurimento dei nutrienti.
   2. Analisi di differenziazione
      1. Ricoprire una piastra 12-pozzetti con 350 µ l di matrice della membrana basale contenente medio di differenziazione (1: 100). Incubare la piastra a 37 ° C per 30 min e rimuovere il mezzo.
      2. Piastra 200.000 cellule/pozzetto in mezzo di differenziazione nella piastra rivestite con matrice. Incubare le cellule in un'incubatrice di coltura cellulare (37 ° C, 5% CO_2, 5% O₂) fino a quando essi aderiscono alla piastra (2h sono generalmente abbastanza per le cellule di aderire e di avviare la differenziazione).
      3. Per valutare la differenziazione, eseguire la colorazione per la catena pesante della miosina e nuclei come descritto in precedenza¹¹. In alternativa, eseguire analisi di vivere-Imaging per applicazioni come descritto di seguito.

4. Live-imaging di differenziamento dei mioblasti e rilevamento nucleare

1. Per live cell imaging, mettere le cellule, ottenute nella sezione 3.2.2 e placcato in un piatto di 12-pozzetti, sotto un microscopio confocale, dotato di un sistema di incubazione per mantenere le cellule a 37 ° C in 5% CO₂.
2. Utilizzare un obiettivo asciutto 20x (0,7 NA) per ottenere campi di vista con centinaia di cellule, abbastanza per monitorare myofiber formazione. Cellule di H2B-GFP possono essere imaged con un laser di Argon di basso-intensità 488 nm.
   Nota: Un foro stenopeico aperto assicura che la profondità dell'immagine (~ 10 µm) contiene lo spessore delle cellule in modo che le cellule sono tenute in stato attivo in tutto l'esperimento. Utilizzando un microscopio confocale è vantaggioso poiché migliora il rapporto segnale-rumore delle immagini, potrebbe essere utilizzata anche grandangolari microscopia. Myofiber formazione possa essere monitorati attraverso il canale di trasmissione.
3. Acquisire immagini di 16 bit e 1.024 x 1.024 pixel per frame ogni 6 min per 16 h. Per ogni posizione acquisita, generare un file di multiframe.tif (Vedi esempio nei File supplementari).
   Nota: Nel presente protocollo, software commerciale connesso con il microscopio (Tabella materiali) è stato utilizzato; utilizzare il software appropriato per raggiungere lo stesso obiettivo, quando si utilizzano altri microscopi.
4. Scarica il software fornito come zip file supplementari.
   Nota: Le routine sono script che deve essere eseguito in MATLAB. Il software è un adattamento di un software pubblicati¹² ottimizzato per il tracciamento dei nuclei durante la formazione dei miotubi. Questo software è diviso in due parti: il primo si identifica i nuclei in ogni fotogramma segmentando li, mentre la seconda si genera "tracce" (traiettorie) del movimento di nuclei. Il codice completo per la segmentazione nucleare e rilevamento e una guida dettagliata introduttiva all'utilizzo sono forniti nei File supplementari.
5. Estrarre il file zip e salvarlo in un percorso desiderato sul personal computer (PC) in uso. Eseguire tutte le sotto passaggi su un PC con il software già installato. Si noti che il file. zip è composta da tre cartelle come indicato di seguito.
   Nota: Segmentazione routine contiene le funzioni da eseguire per la segmentazione. Routine di rilevamento, invece, contiene le funzioni necessarie per il tracciamento. Esempio di segmentazione di rilevamento fornisce i file per familiarizzare con il sistema e gli script di base. Il software utilizzato per la segmentazione e rilevamento dei nuclei viene eseguito correttamente in MATLAB, R2015a o versioni successive.
6. Per segmentare i nuclei dal file con estensione TIF, nome del file, ad esempio, NameFile.tif.
   1. Aprire la cartella di Esempio di segmentazione di rilevamento e fare clic su DoSegmentation.m. Verrà aperta la finestra di comando in MATLAB.
   2. Controllare la finestra di Cartella corrente sulla sinistra per vedere tutti gli elementi nella cartella di Esempio di segmentazione di rilevamento . Fare doppio clic su DoSegmentation.m.
      Nota: Informazioni dettagliate sulle modifiche che devono essere fatte nello script possono essere trovate nel file StepbyStep.txt. È obbligatorio per modificare lo script in modo che la variabile filenameinput è NameFile.tif e folderinput è la cartella dove è contenuto il file con estensione TIF.
   3. Eseguire lo script (cliccando sul verde pulsante Esegui ). Il risultato della segmentazione verrà salvato come un file.mat (SegmentedNameFile.mat), mentre la segmentazione dei nuclei possa essere visualizzata nella figura uscita.
      Nota: I parametri per la segmentazione, descritto nello script, possono essere modificati se necessario. La qualità della segmentazione può essere controllata utilizzando lo script CheckSegmentation.m (vedere il file StepbyStep.txt). Sulla base di questo, se la qualità della segmentazione è scarsa (solo pochi nuclei di rilevato), regolare i parametri della segmentazione, chiaramente indicata nello script DoSegmentation.m e ripetere la procedura.
7. Per generare le tracce (cioè, le traiettorie di ciascuno dei nuclei nel tempo), usando le posizioni nucleare ottenuta nella segmentazione, eseguire lo script GenerateTracks.m nella stessa cartella di lavoro. Assicurarsi di aggiungere il file corretta segmentazione come input, ottenuti prima (vedere il file StepbyStep.txt per maggiori informazioni).
   Nota: Come un'uscita, l'utente otterrà un file TrackedNameFile.mat, con una matrice per le coordinate x e un'altra matrice per le coordinate y dei brani generati.
8. Valutare la qualità delle tracce utilizzando CheckTracking.m (vedere il file StepbyStep.txt per maggiori informazioni). Utilizzare la figura di uscita di questo ultimo passaggio consente di visualizzare ogni posizione di nuclei in tempo. Verifica sulla sinistra per croci verdi che indicano ogni nucleo segmentato. Per selezionare uno specifico nucleo, utilizzare la barra di scorrimento inferiore. Si noti che il nucleo selezionato sarà cerchiato in rosso, mentre sulla destra, la traiettoria della cella selezionata può essere seguita nel tempo (utilizzando la barra di scorrimento superiore).

Risultati

Per seguire automaticamente movimento nucleare durante la differenziazione dei mioblasti in vivo imaging, i nuclei fluorescente preferenzialmente devono essere etichettati. È importante notare che utilizzando molecole intercalanti del DNA non è fattibile perché queste molecole interferiscono con la proliferazione e la differenziazione di mioblasti primari¹³. Ad esempio, proliferazione e differenziazione sono state analizzate in mioblasti primari coltivate con o ...

Discussione

Fibre muscolari (myofibers) sono multinucleate che si formano dalla fusione di cellule precursori muscolari (mioblasti) derivata da cellule staminali del muscolo (cellule satelliti) che subiscono la proliferazione e la differenziazione^{2,3, 4}. Per valutare stimola il differenziamento, la procedura comune consiste di coltura mioblasti in differenziando le medie e fissare le cellule in diversi momenti per eseguire immunofluorescen...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
chicken embryos extract	Seralab	CE-650-J
collagenase	Sigma	C9263-1G	125units/mg
collagen from calf skin	Sigma	C8919
dispase	Gibco	17105-041	1.78 units/mg
doxyciclin	Sigma	D1515
DMEM	Sigma	D5671
fetal bovine serum	Life technologies	10270106
gentamicin	Sigma	G1397
Horse serum	Invitrogen	16050-098
Hoechst	life technologies	33342
IMDM	Sigma	I3390
L-glutamine	Sigma	G7513
Matrigel	Corning	356231
penicillin-streptomycin	Sigma	P0781
red blood cells lysis medium	Biolegend	420301
Digestion medium
collagenase	40 mg
dispase	70 mg
PBS	20 ml
filtered 0.22um
Blocking medium
DMEM
Fetal bovine serum	10%
L-glutammine	1%
penicillin-streptomycin	1%
gentamicin	1 ‰
filtered 0.22um
proliferation medium
IMDM
Fetal bovine serum	20%
L-glutammine	1%
penicillin-streptomycin	1%
gentamicin	1 ‰
chichen embryo extract	3%
filtered 0.22um
differentiation medium
IMDM
Horse serum	2%
L-glutammine	1%
penicillin-streptomycin	1%
gentamicin	1 ‰
chichen embryo extract	1%
filtered 0.22um