Parça çekirdeği canlı görüntüleme sırasında Myoblast farklılaşma ve füzyon istismar

Özet

Kas iskelet farklılaşma özellikle nükleer konumlandırma üzerinde dayanır son derece dinamik bir süreçtir. Burada, yanında canlı hücre düşsel myoblast farklılaşma ve myotube oluşumu sırasında çekirdeği hareketlerini takip ve otomatik izleme bilgileri ayıklanıyor tarafından çekirdek dynamics nicel bir karakterizasyonu gerçekleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Özet

Nükleer içindeki hücreleri konumlandırma geliştirme ve yenileme içinde birden çok hücresel süreçler için önemlidir. Nükleer konumlandırma en ilginç örnek kas iskelet farklılaşma sırasında oluşur. Kas lifleri (myofibers) kas öncül hücreleri (myoblasts) kas kök bu yayılma ve farklılaşma geçmesi hücrelerden (uydu hücreleri) türetilmiş füzyon tarafından kurulan multinucleated hücrelerdir. Doğru nükleer myofibers içinde konumlandırma uygun kas rejenerasyon ve işlevi için gereklidir. Sabit hücreleri tarafından incelendi nükleer hareketi ve hücre davranış çalışmanın zaman içinde engellemektedir ayirt myoblast farklılaşma ve myofiber oluşumu değerlendirmek için genel yordamı kullanır. Burada, canlı hücre görüntüleme tarafından myoblast farklılaşma ve myofiber oluşumu analizi için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz bir yüksek-den geçerek nicel karakterizasyonu nükleer dinamikleri ve myoblast davranış (yani, yörünge) sırasında farklılaşma ve füzyon elde etmek nükleer otomatik izleme için bir yazılım sağlar.

Giriş

Kas iskelet % 35-40 beden kitle^%1toplam insan vücudundaki en büyük dokudur. Uydu hücrelerdir kas kök hücre, anatomik olarak karakterize Proliferasyona myoblasts (myogenic progenitör hücre) ortaya çıkmasına, (kas liflerinin Bazal lamina altından plazma zarı için bitişik), onların konuma göre hangi sonunda ayırt etmek ve varolan myofibers entegre ve/veya sigorta formu yeni myofibers^2,3,4' e. Onların keşif ve biyolojilerinin çalışma sürüyor kas geliştirme ve yenileme önemli anlayışlar için açmıştır.

Protokolleri yalıtmak ve myoblasts myotubes ayırt etmek için yıllar önce geliştirilmiş ve hala yaygın olarak kas iskelet farklılaşma^5,6,7incelemek için kullanılır. Ancak, bu yöntemlerin çoğu sabit hücreleri analizine dayanan ve sonuç olarak, bilim adamları tam olarak myoblast fusion ve myofiber olgunlaşma gibi son derece dinamik süreçler keşfetmek izin vermez statik yordamlar temsil eder. En çarpıcı örnek nükleer konumlandırma, hangi sıkıca başlangıçta myofiber merkezinde çekirdek ile düzenlenir ve, sonra sonra myofiber olgunlaşma^8,9çevre bulunan olmasıdır. Canlı görüntüleme daha da kendine özgü bir fenomen anlayışlar elde etmek için en uygun bir tekniktir.

Burada, bilim adamları tarafından hızlandırılmış mikroskopi myoblast farklılaşma ve myotube oluşumu kaydetmek için ve kantitatif analizleri myoblast çekirdeği otomatik izleme üzerinden gerçekleştirmek için sağlar bir yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem yüksek üretilen iş bir nicel karakterizasyonu nükleer dinamikleri ve myoblast davranış sırasında farklılaşma ve füzyon sağlar. Protokol dört farklı parçalar, yani kas fareler, (2) hindlimbs üzerinden (1 topluluğu mekanik ve Enzimatik sindirim, (3) myoblast yayılması ve farklılaşma ve (4) oluşan birincil myoblasts yalıtım ayrılmıştır çekirdeği ilk 16 h myoblast farklılaşma içinde izlemek için görüntüleme yaşıyor.

Aşağıdaki yordamda, myoblasts H2B GFP fareler izole ve 1 µg/mL olarak yukarıda açıklanan¹⁰H2B GFP ifade ikna etmek için Doksisiklin ile tedavi. Alternatif olarak, myoblasts çekirdeği floresan bir protein hızlı diğer transgenik fareler gelen izole veya çekirdek, floresan bir protein hızlı farelerde vahşi-tip üzerinden Pimentel ve ark tarafından açıklandığı gibi izole hücreler transfect mümkündür. ⁹.

Protokol

Hayvan konular içeren tüm yordamları San Raffaele kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından kabul edildi.

1. fare hindlimb kasları diseksiyon

1. Cımbız ve makas (düz ve eğri) tarafından ısıyla sterilize.
2. Hazırlamak ve deney başlamadan önce tüm medya (engelleme orta, sindirim orta, orta Proliferasyona ve orta ayırt) (0,22 µm) filtre ( Tablo malzemelerigörmek).
3. Fosfat tamponlu tuz (PBS) 5 mL 35 mm kas koleksiyonu için Petri kabına koyun.
4. Servikal yerinden çıkması veya CO₂ kullanarak fare kurban ve cilt etanol ile sterilize. Deri hindlimbs ve üst ekstremite kasları yalıtım kolaylaştırmak için makas ve cımbız kullanarak çıkarın.
   Not: Kas yenidoğan veya yetişkin fareler ayrılmış olabilir. Yenidoğan fareler uydu yetişkin fareler için karşılaştırıldığında hücreleri artan sayıda var. Ancak, tek bir yetişkin fare ayrılmış olabilir uydu hücrelerin toplam sayısı aşağıda açıklanan deney gerçekleştirmek için yeterli.
5. Tibialis, soleus, ekstansiyon digitorum longus (EDL), gastroknemius, kuadriseps ve triceps izole etmek ve PBS içeren kabında koydu. Yemeğin buz üzerinde bırakın. Tendon ve fat sterilize makas ve cımbız ile dikkatli bir şekilde çıkarın.

2. birincil myoblasts yalıtım

Not: Hücre kültürü için tüm yordamları steril koşullarda yapılır.

1. Kasları PBS kaldırın. Kesin ve tek tip bir kitle elde edilir kadar steril eğri makas kullanarak kasları, bin dereden su getirmek. Kas adet 50 mL tüp içine koyun.
2. Sindirim orta 10 mL kas parçaları ekleyin ve altında güçlü ajitasyon (250 dk^-1) kasları enzimatik sindirimi bir su banyosunda 30 dakika 37 ° C'de kuluçkaya.
3. Dulbecco'nın 10 mL % 10 fetal sığır serum (FBS), % 1 glutamin, % 1 penisilin/streptomisin ve hazım durdurmak için % 1 gentamisin (engelleme orta) içeren kartal orta (DMEM) değiştiren ekleyin.
4. 40 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi ve süpernatant 50 mL tüp içinde toplamak. Pelet buza kaydedin.
   Not: Pelet sindirilmemiş kas ve bağ dokusu parçalar içerirken Santrifüjü sonra süpernatant bazı uydu hücreler, kan hücreleri, endotel hücreleri ve fibroblastlar, içerir. İzole hücre sayısını artırmak için Pelet ek adımlar aşağıda açıklandığı gibi sindirim tabi gerekir.
5. Süpernatant 650 x g 5 dk. atmak için de süpernatant santrifüj kapasitesi ve Pelet 1 mL % 10 içeren DMEM resuspend FBS. Resuspended Pelet buz üzerinde tutun.
6. 2,2-2,5 Pelet kalanı için 2 x 2.4. adımda elde adımları yineleyin ve daha sonra resuspended granül buzda korunmuş ilk resuspended Pelet ekleyin.
7. Resuspended granül 70 µm filtre ve daha sonra 40 µm filtre üzerinden geçmek. DMEM 15 mL %10 FBS ve santrifüj ile 650 x g 5 min için ekleyin.
8. Hücre Pelet 3 mL kırmızı kan hücreleri tüketmek için kırmızı kan hücre lizis tampon resuspend. Oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya. Kırmızı kan hücrelerinin lizis durdurmak ve 650 x g 5 dk. Kaldır süpernatant de santrifüj kapasitesi ve DMEM 5 ml % 10 ile Pelet resuspend PBS 40 mL ekleyin FBS.
9. Preplating adım olarak, 20 mL 150 mm kaplamasız Petri kabına yayılması orta hücrelerde plaka. (37 ° C, % 5 CO₂) bir hücre kültür kuluçka kuluçka 1 saat sonra orta toplamak.
   Not: uydu hücre süspansiyon kalırken fibroblastlar plaka, bağlama, sonra atılır.
10. Adım 2.9 3 x ve son preplating adımda tekrar, süspansiyon uydu hücreleri içeren orta toplamak.
11. 5 min için 650 x g , santrifüj.
12. Hücreleri centrifuging iken, kollajen (10 mL 0.1 M Asetik asit % 0,1 çözeltilerine) ile 150 mm Petri tabağı kat. Bunu yapmak için kollajen tabağa koy, 5 min için kuluçkaya ve çıkarmak o. 30 dk için Kuru plaka izin.
13. 2.11. adımda elde süpernatant atın ve hücre Pelet yayılması orta (Tablo reçetesi) 40 mL resuspend. 150 mm kolajen kaplı Petri tabağı (çanak başına 20 mL) hücrelerdeyse plaka ve hücreler bir hücre kültür kuluçka (37 ° C, % 5 CO_2, %5 O₂) 1 µg/mL Doksisiklin H2B GFP ifade ikna etmek için 2-3 gün boyunca yayılması orta tutmak.
    Not: Bu adımı hücreleri daha fazla deneyleri için daha yüksek bir dizi elde etmek için myoblasts yayılması izin verir. Hücre yoğunluğu myoblasts spontan bir farklılaşma myotubes içine önlemek için çok düşük tutulur.

3. Myoblast yayılması ve farklılaşma deneyleri

Not: myoblast yoğunluğu yüksek olduğunda, bazı hücreler uzama başlatmak ve sonra hücreleri bölmek gereklidir. Genel olarak, onların fenotip etkilemeden hücreleri 2 x-3 x bölmek mümkündür.

1. Orta atmak, 5 mL de PBS hücrelerle yıkama, tripsin (1 x), 2 mL ekleyin ve mikroskop altında 5 dk. onay için bir hücre kuluçka 37 ° C'de plaka kuluçkaya ve, yuvarlak hücre ayırdığınızda, DMEM 5 mL % 10 ile ekleyin FBS tripsin devre dışı bırakabilirsiniz. Hücre sayısını (genellikle 1 x 10⁶ hücreler/fare elde etmek mümkündür).
   Not: Kuluçka 5 min için tripsin ile zaman öyledir Proliferasyona myoblasts ayırmak yeterli.
2. Hücreleri aşağıda açıklanan deneyleri biri tabi.
   1. Nükleer silahların yayılmasına karşı tahlil
      1. 50.000 hücreleri/iyi 1 mL/de yayılması orta bir kolajen kaplı 12-şey plaka, plaka ve bir hücre kültür kuluçka (37 ° C, % 5 CO₂) kaplama hücreleri kuluçkaya. Fix ve 24, 48 veya 72 h hücreleri saymak.
         Not: Orta besin tükenme önlemek için her 48 h yerini alır.
   2. Farklılaşma tahlil
      1. 12-şey plaka ile 350 µL farklılaşma orta içeren membran Matrix (1: 100) kat. Plaka için 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya ve orta kaldırın.
      2. 200.000 hücreler/kuyuda farklılaşma orta matris kaplı plaka plaka. Bir hücre kültür kuluçka (37 ° C, % 5 CO_2, %5 O₂) hücreleri kuluçkaya kadar onlar için plaka uygun (2 h hücreler genellikle yeterince için uygun ve farklılaşma başlatmak için).
      3. Farklılaşma değerlendirmek için myosin ağır zincir ve çekirdekler için yukarıda açıklanan¹¹boyama gerçekleştirin. Alternatif olarak, aşağıda açıklandığı gibi canlı görüntüleme analizi gerçekleştirin.

4. myoblast farklılaşma ve nükleer izleme Live-görüntüleme

1. Imaging canlı hücre için hücreleri 3.2.2 bölümünde elde edilen ve % 5 CO₂37 ° C'de hücreleri korumak için bir kuluçka sistemi ile donatılmış bir confocal mikroskop altında bir 12-şey plaka kaplama koymak.
2. Bir 20 x kuru hedefi (0.7 NA) hücreleri, yeterince myofiber oluşumu izlemek için yüzlerce ile görüş alanları almak için kullanın. H2B GFP hücreleri düşük yoğunluktaki 488 nm Argon lazer ile yansıması.
   Not: Açık bir iğne deliği hücreleri odak deneme boyunca tutulur Resim derinliğini (~ 10 µm) hücre kalınlığı içeren sağlar. Sinyal-gürültü oranı, görüntülerin geliştirir beri confocal bir mikroskop kullanarak, geniş alanlı mikroskobu de kullanılabilir, ancak avantajlıdır. Myofiber oluşumu iletim kanalı ile izlenebilir.
3. 16-bit ve 1024 x 1024 piksel kare 16 h için her 6 min başına görüntülerini elde etmek. Alınan her pozisyon için bir multiframe.tif dosyası oluşturma ( Ek dosyalarıörneğe bakın).
   Not: mevcut protokolünde, mikroskop (Malzemeler tablo) ile ilişkili ticari yazılım kullanılan; diğer mikroskoplar kullanırken aynı hedefe ulaşmak için uygun yazılımı kullanın.
4. Bir .zip ek dosyaolarak sağlanan yazılımı indirin.
   Not: Rutinleri MATLAB'de çalıştırılması gereken komut dosyalarıdır. Yazılım çekirdek izleme myotube oluşumu sırasında en iyi duruma getirilmiş bir yayımlanmış yazılım¹² bir uyarlamasıdır. Bu yazılım iki bölüme ayrılmıştır: ilk çekirdeği her çerçeve içinde ikinci bir "parça" (yörüngeleri) çekirdeği hareketinin oluşturur iken onlara göre bölümleme tanımlar. Nükleer segmentasyon ve izleme ve başlangıç bir adım adım kılavuzu için tam kod Ek dosyalarıtemin edilmektedir.
5. Hulâsa belgili tanımlık fermuar eğe ve istenen bir yoldaki kullanımda kişisel bilgisayar (PC) kaydedin. Tüm yerine pasajlar gerekli yazılımı zaten yüklü olan bir bilgisayarda aşağıda. Not aşağıda belirtildiği gibi .zip dosyası üç klasör oluşmaktadır.
   Not: İşlevleri bölümleme için çalıştırılması için segment oluşturma yordamları içerir. İzleme rutinleri, bunun yerine, izleme için gereken işlevler içerir. Örnek bölümleme izleme dosya sistemi ile daha yakından tanımak için ve temel komut dosyaları sağlar. Bölümleme için kullanılan yazılım ve çekirdek izleme düzgün MATLAB, R2015a veya sonraki sürümlerinde çalışır.
6. Çekirdeklerin .tif dosya segmentlere ayırmak için örneğin, NameFile.tifdosya adı.
   1. Örnek bölümleme izleme klasörü açın ve DoSegmentation.müzerinde'yi tıklatın. Bu MATLAB komut penceresi açılacaktır.
   2. Segmentasyon, örnek izleme klasöründeki tüm öğeleri görmek için soldaki Geçerli klasör penceresini denetleyin. DoSegmentation.müzerinde çift tıklatın.
      Not: Komut dosyasında yapılması gereken değişiklikler hakkında ayrıntılı bilgi StepbyStep.txt dosyasında bulunabilir. Komut dosyası değişkeni filenameinput NameFile.tif ve folderinput .tif dosyası bulunduğu klasörü değiştirmek için zorunludur.
   3. Komut dosyasını çalıştırmak (yeşil tıklayarak Çalıştır düğmesini). Çekirdeklerin ayrılmasını çıktı resimde görüntülenmeyecektir ise ayrılmasını sonucu bir file.mat (SegmentedNameFile.mat) kaydedilir.
      Not: Gerekirse komut dosyasında açıklanan ayrılmasını için parametreler değiştirilebilir. Ayrılmasını kalitesini CheckSegmentation.m komut dosyası kullanarak kontrol edilebilir (StepbyStep.txt dosyasına bakın). Ayrılmasını kalitesini zavallı ise bu, temel (tespit sadece birkaç çekirdeği), segmentasyon, açıkça DoSegmentation.m komut dosyasında belirtilen parametreleri ayarlamak ve yordamı yineleyin.
7. (Yani, her zaman çekirdek yörüngeleri) parça üretmek için nükleer pozisyonlar kullanılarak ayrılmasını, elde edilen komut çalıştırmak GenerateTracks.m aynı çalışma klasörü içinde. Uygun segmentasyon dosya bir giriş olarak eklemek emin olun (bkz: daha fazla bilgi için StepbyStep.txt dosyasına) önce elde edilen.
   Not: bir çıktı, kullanıcı bir dosya TrackedNameFile.mat, bir matris x koordinatları için ve başka bir matris için oluşturulan parça y koordinatlarını elde edecek.
8. CheckTracking.m kullanarak izler kalitesini değerlendirmek (daha fazla bilgi için StepbyStep.txt dosyasına bakın). Bu son geçiş çıktı rakam her zaman çekirdek bulunduğu görselleştirmek yardımcı olması için kullanın. Soldaki her kesimli çekirdeği gösteren yeşil Haç için kontrol edin. Belirli bir çekirdek seçmek için alt kaydırma çubuğunu kullanın. Seçili çekirdeği circled Not kırmızıyla, sağda ise, seçili hücre yörüngesini zamanında (üst kaydırma çubuğunu kullanarak) izlenebilir.

Sonuçlar

Otomatik olarak myoblast farklılaşma canlı görüntüleme sırasında nükleer hareketi takip etmek, çekirdeklerin tercihen fluorescently biçiminde etiketlenmiş olmalıdır. Bu moleküller nükleer silahların yayılmasına karşı birincil myoblasts¹³farklılaşma ile müdahale çünkü DNA enterkalasyon molekülleri kullanarak mümkün olmadığını unutmamak gerekir. Örnek olarak, yayılmasını önleme ve farklılaşma birincil myoblasts ile ya da ezel?...

Tartışmalar

Kas lifleri (myofibers) kas kök yayılması ve farklılaşma^{2,3tabi bu hücrelerden (uydu hücreleri) türetilmiş füzyon kas öncüleri hücre (myoblasts) tarafından kurulan multinucleated hücrelerdir, 4}. Myoblast farklılaşma değerlendirmek için orta farklılaştırılması ve MyHC, bir işareti farklılaşma ve, boyama boyama ayirt gerçekleştirmek için farklı zaman noktalarda hücreleri tamir myoblasts Kültür ge...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
chicken embryos extract	Seralab	CE-650-J
collagenase	Sigma	C9263-1G	125units/mg
collagen from calf skin	Sigma	C8919
dispase	Gibco	17105-041	1.78 units/mg
doxyciclin	Sigma	D1515
DMEM	Sigma	D5671
fetal bovine serum	Life technologies	10270106
gentamicin	Sigma	G1397
Horse serum	Invitrogen	16050-098
Hoechst	life technologies	33342
IMDM	Sigma	I3390
L-glutamine	Sigma	G7513
Matrigel	Corning	356231
penicillin-streptomycin	Sigma	P0781
red blood cells lysis medium	Biolegend	420301
Digestion medium
collagenase	40 mg
dispase	70 mg
PBS	20 ml
filtered 0.22um
Blocking medium
DMEM
Fetal bovine serum	10%
L-glutammine	1%
penicillin-streptomycin	1%
gentamicin	1 ‰
filtered 0.22um
proliferation medium
IMDM
Fetal bovine serum	20%
L-glutammine	1%
penicillin-streptomycin	1%
gentamicin	1 ‰
chichen embryo extract	3%
filtered 0.22um
differentiation medium
IMDM
Horse serum	2%
L-glutammine	1%
penicillin-streptomycin	1%
gentamicin	1 ‰
chichen embryo extract	1%
filtered 0.22um