Nutzung von Live Imaging Track Kerne während Myoblast Differenzierung und Fusion

Zusammenfassung

Skelettartiger Muskel Differenzierung ist ein sehr dynamischer Prozess, der besonders auf nukleare Positionierung stützt. Hier beschreiben wir eine Methode um Kerne Bewegungen von live Cell Imaging während Myoblast Differenzierung und Myotube Bildung verfolgen und eine quantitative Charakterisierung der Kerne Dynamik durch Extrahieren von Informationen aus automatisches Tracking durchzuführen.

Zusammenfassung

Nukleare Positionierung innerhalb der Zellen ist wichtig für mehrere zelluläre Prozesse in Entwicklung und Erneuerung. Die faszinierendste Beispiel für nukleare Positionierung tritt während der Skelettmuskulatur Differenzierung. Muskelfasern (Myofibers) sind mehrkernigen Zellen gebildet durch die Fusion von Muskel Vorläuferzellen (Myoblasten) abgeleitet von Muskelstammzellen (Satelliten-Zellen), die Proliferation und Differenzierung zu unterziehen. Richtige nukleare Positionierung innerhalb Myofibers ist erforderlich für die ordnungsgemäße Muskelregeneration und Funktion. Des gemeinsamen Verfahrens Myoblast Differenzierung und Myofiber Bildung Bewertung stützt sich auf feste Zellen analysiert durch Immunfluoreszenz, die das Studium der atomaren Bewegung und Zelle Verhalten im Laufe der Zeit behindert. Hier beschreiben wir eine Methode zur Analyse von Myoblast Differenzierung und Myofiber Bildung von live Cell Imaging. Wir bieten eine Software für die automatisierte nuklearen Verfolgung eine Hochdurchsatz-quantitative Charakterisierung der nuklearen Dynamik und Myoblast Verhalten (d. h. die Flugbahn) während der Differenzierung und Fusion zu erhalten.

Einleitung

Skelettmuskulatur ist das größte Gewebe im menschlichen Körper, in Höhe von 35 % - 40 % des Körper-Masse-¹. Satellitenzellen sind Muskelstammzellen, anatomisch zeichnet sich durch ihre Position (gegenübergestellt, der Plasmamembran, darunter die Basallamina der Muskelfasern), die wuchernden Myoblasten (myogen Vorläuferzellen) hervorrufen, die schließlich unterscheiden und in bestehende Myofibers integrieren bzw. Sicherung in Form neuer Myofibers^2,3,4. Ihre Entdeckung und den Fortschritt in der Studie von ihrer Biologie führte zu bedeutende Einblicke in Muskelaufbau und Regeneration.

Protokolle zu isolieren und zu differenzieren Myoblasten in Myotubes wurden vor vielen Jahren entwickelt und sind noch weit verbreitet, Skelettmuskel Differenzierung^5,6,7zu studieren. Jedoch sind die meisten dieser Methoden statischen Verfahren, die verlassen Sie sich auf die Analyse von festen Zellen und folglich erlauben keine Wissenschaftler, hochdynamische Prozesse, wie z. B. Myoblast Fusion und Myofiber Reifung zu erforschen. Das markanteste Beispiel ist nuklearen Positionierung, welche streng reguliert, mit Kernen zunächst in der Mitte der Myofiber und, dann, befindet sich an der Peripherie nach Myofiber Reifung^8,9. Live Bildgebung ist die am besten geeignete Technik um weitere Einblicke in dieses eigenartige Phänomen zu erhalten.

Hier beschreiben wir eine Methode, die Wissenschaftler Myoblast Differenzierung und Myotube Bildung von Time-Lapse Mikroskopie aufzuzeichnen und Quantitative Analysen über die automatische Verfolgung der Myoblast Kerne ausführen zu können. Diese Methode bietet eine Hochdurchsatz-quantitative Charakterisierung der nuklearen Dynamik und Myoblast Verhalten während der Differenzierung und Fusion. Das Protokoll vier verschiedene Teile, nämlich (1) die Sammlung von Muskeln aus der Hintergliedmaßen von Mäusen, (2) die Isolierung der primären Myoblasten gliedert sich in die mechanische und enzymatische Verdauung, (3) Myoblast Proliferation und Differenzierung (4) besteht Live-imaging, Kerne innerhalb der ersten 16 h der Myoblast Differenzierung zu verfolgen.

In der folgenden Prozedur Myoblasten von H2B-GFP Mäusen isoliert und mit 1 µg/mL von Doxycyclin induzieren H2B-GFP Ausdruck, wie zuvor beschrieben¹⁰behandelt. Alternativ ist es möglich, die Myoblasten aus anderen transgenen Mäusen isolieren, die ein fluoreszierendes Protein im Zellkern ausdrücken oder isolierten von Wildtyp Mäusen ein fluoreszierendes Protein im Zellkern, zum Ausdruck bringen, wie von Pimentel Et al. beschrieben Zellen zu transfizieren. ⁹.

Protokoll

Alle Verfahren, die tierische Themen wurden durch die San Raffaele institutionelle Animal Care und Use Committee genehmigt.

1. Präparation der Maus Megalosauridae Muskeln

1. Pinzetten und Scheren (gerade und gebogene) durch Autoklavieren zu sterilisieren.
2. Vorbereiten und Filtern (0,22 µm) alle Medien (blockierende Medium, Medium, Verdauung, wuchernden Medium und Medium zu unterscheiden) vor Beginn des Experiments (siehe Tabelle der Materialien).
3. Setzen Sie 5 mL des Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) in einem 35 mm Petrischale für Muskel-Sammlung.
4. Opfern Sie die Maus durch zervikale Dislokation oder mithilfe von CO₂ zu und sterilisieren Sie die Haut mit Ethanol. Entfernen Sie die Haut von der Hinterbeine und der oberen Gliedmaßen mit Schere und Pinzette, um die Isolation der Muskeln zu erleichtern.
   Hinweis: Muskeln können von Neugeborenen oder Erwachsenen Mäusen isoliert werden. Neugeborene Mäuse haben eine erhöhte Anzahl von Satelliten-Zellen im Vergleich zu Erwachsenen Mäusen. Die Gesamtzahl der Satellitenzellen, die aus einer einzigen Erwachsenen Maus isoliert werden können ist jedoch ausreichend, um die unten beschriebenen Experiment durchführen.
5. Tibialis, Soleus Beinstrecker m.digitorum Longus (EDL), Gastrocnemius, Quadrizeps und Trizeps zu isolieren, und steckte sie in die Petrischale mit PBS. Lassen Sie die Schale auf Eis. Entfernen Sie sehnen und Fett mit sterilisierten Schere und Pinzette sorgfältig.

2. Isolierung der primären Myoblasten

Hinweis: Alle Verfahren für die Zellkultur sind unter sterilen Bedingungen durchgeführt.

1. Entfernen Sie die Muskeln von PBS. Schneiden Sie und zerkleinern Sie die Muskeln mit sterilen gebogene Schere, bis eine einheitliche Masse entsteht. Setzen Sie die Muskel-Stücke in einer 50 mL-Tube.
2. Die Muskel-Stücke 10 mL des Mediums Verdauung hinzu und Inkubation bei 37 ° C für 30 min unter starkem rühren (250 min^-1) in einem Wasserbad, um die Muskulatur enzymatisch zu verdauen.
3. Fügen Sie 10 mL Dulbecco des Adlers 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 1 % Glutamin, 1 % Penicillin/Streptomycin und Gentamicin 1 % (blockierende Mittel), die Verdauung zu stoppen-haltigem Medium (DMEM) geändert.
4. 40 X g für 5 min zentrifugiert und den Überstand in ein 50 mL-Tube sammeln. Speichern Sie das Pellet auf Eis.
   Hinweis: Nach der Zentrifugation enthält der überstand einige Satelliten-Zellen, Blutkörperchen, Endothelzellen und Fibroblasten, während das Pellet Stücke von unverdauten Muskel- und Bindegewebe enthält. Um die Anzahl der isolierten Zellen zu erhöhen, muss zusätzliche Schritte der Verdauung wie unten beschrieben das Pellet unterzogen werden.
5. Zentrifugieren dem Überstand bei 650 X g für 5 min. verwerfen den Überstand und Aufschwemmen das Pellet in 1 mL DMEM mit 10 % FBS. Halten Sie die resuspendierte Pellet auf Eis.
6. Wiederholen Sie die Schritte 2,2-2,5 2 X für den Rest des Geschosses im Schritt 2.4 erhalten und fügen Sie anschließend resuspendierte Pellets zum ersten resuspendierte Pellet konserviert auf Eis.
7. Übergeben Sie die resuspendierte Pellets durch einen 70 µm-Filter und dann durch einen 40 µm-Filter. 15 mL DMEM mit 10 % FBS und Zentrifuge bei 650 X g für 5 min hinzufügen.
8. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 3 mL der roten Blutzelle Lysis Puffer, zum Abbau der roten Blutkörperchen. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. Fügen Sie 40 mL PBS zu stoppen die lyse der roten Blutkörperchen und Zentrifugieren bei 650 X g für 5 min. Überstands entfernen und erneut das Pellet in 5 mL DMEM mit 10 % FBS.
9. Als preplating Schritt Platte Zellen in 20 mL Medium der Verbreitung in einer 150 mm unbeschichtet Petrischale. Nach 1 h Inkubation in einer Zelle Kultur Inkubator (37 ° C, 5 % CO₂) das Medium zu sammeln.
   Hinweis: Fibroblasten, Befestigung an der Platte werden dann verworfen, während Satellitenzellen in der Schwebe bleiben.
10. Wiederholen Sie Schritt 2,9 3 x und im letzten Schritt preplating, sammeln Sie das Medium, das die Satelliten-Zellen in der Suspension enthält.
11. Zentrifuge bei 650 X g für 5 Minuten.
12. Während die Zellen Zentrifugieren sind, Mantel zwei 150 mm Petrischalen mit Kollagen (10 mL einer 0,1 % igen Lösung in 0,1 M Essigsäure). Dies zu tun, das Kollagen auf die Platte legen, 5 min inkubieren, entfernen es. Lassen Sie die Platte für 30 min trocknen.
13. Verwerfen des Überstands in Schritt 2.11 erhaltenen und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 40 mL Verbreitung Medium (Table of Materials). Platte der Zellen auf zwei 150 mm Kollagen-beschichteten Petrischalen (20 mL pro Teller) und halten Sie die Zellen in einer Zelle Kultur Inkubator (37 ° C, 5 % CO_2, 5 % O₂) im Medium der Verbreitung für 2 – 3 Tage mit 1 µg/mL von Doxycyclin, H2B-GFP Expression induzieren.
    Hinweis: In diesem Schritt können die Verbreitung von Myoblasten, eine höhere Anzahl von Zellen für weitere Tests zu erhalten. Zelldichte bleibt sehr niedrig, um eine spontane Ausdifferenzierung der Myoblasten in Myotubes zu vermeiden.

3. Myoblast Proliferation und Differenzierung assays

Hinweis: Wenn Myoblast Dichte hoch ist, einige Zellen initiieren Dehnung, und dann ist es notwendig, die Zellen geteilt. Im Allgemeinen ist es möglich, Zellen 2 x-3 x zu teilen, ohne Auswirkungen auf den Phänotyp.

1. Entsorgen Sie das Medium, waschen Sie die Zellen mit 5 mL PBS, fügen Sie 2 mL Trypsin (1 X), und inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C in einer Zelle Inkubator für 5 min. Check unter die Lupe genommen und, wenn Rundzellen zu lösen, fügen 5 mL DMEM mit 10 % FBS, die Trypsin zu inaktivieren. Die Anzahl der Zellen (in der Regel ist es möglich, ca. 1 x 10⁶ Zellen/Maus zu erhalten).
   Hinweis: Inkubation mit Trypsin für 5 min ist in der Regel genug, um die wuchernden Myoblasten lösen.
2. Unterziehen Sie die Zellen auf eines der unten beschriebenen Assays.
   1. Verbreitung-assay
      1. 50.000 Zellen/Brunnen in 1 mL/auch der Verbreitung von mittlerer eine Kollagen-beschichtete 12-Well-Platte-Platte und inkubieren Sie die vergoldeten Zellen in einer Zelle Kultur Inkubator (37 ° C, 5 % CO₂). Beheben Sie und zählen Sie die Zellen 24, 48 oder 72 h.
         Hinweis: Das Medium wird alle 48 h ersetzt, um Nährstoff Erschöpfung zu vermeiden.
   2. Differenzierung-assay
      1. Bestreichen Sie eine 12-Well-Platte mit 350 µL Differenzierung mittlere enthaltenden Basalmembran Matrix (1: 100). Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C für 30 min und entfernen Sie das Medium.
      2. Platte 200.000 Zellen/Brunnen mittelfristig Differenzierung in der Matrix-beschichtete Platte. Inkubieren Sie die Zellen in einer Zelle Kultur Inkubator (37 ° C, 5 % CO_2, 5 % O₂) bis sie an der Platte haften (2 h sind in der Regel genug für die Zellen haften und Differenzierung zu starten).
      3. Um Differenzierung zu beurteilen, führen Sie beflecken für Myosin heavy Chain und Kerne als zuvor beschriebenen¹¹. Alternativ führen Sie live-Imaging-Analysen, wie unten beschrieben.

4. Live-Darstellung der Myoblast Differenzierung und nukleare tracking

1. Für live Cell imaging habe die Zellen, in Abschnitt 3.2.2 erhalten und in einem 12-Well-Platte unter einem confocal Mikroskop, ausgestattet mit einem Inkubationssystem weiterhin die Zellen bei 37 ° C in 5 % CO₂vernickelt.
2. Verwenden Sie eine trockene Objektiv 20 X (0,7 NA) Gesichtsfelder bekommen mit Hunderten von Zellen genug Myofiber Bildung zu überwachen. H2B-GFP Zellen können mit einem niedrigen 488 nm Argonlaser abgebildet werden.
   Hinweis: Ein offenes Loch sorgt dafür, dass die Bildtiefe (~ 10 µm) die Dicke der Zelle enthält, so dass Zellen im Fokus in das Experiment gehalten werden. Mit einem konfokalen Mikroskop ist vorteilhaft, da es das Signal-Rausch-Verhältnis des Bildes verbessert, obwohl Weitfeld-Mikroskopie auch verwendet werden könnte. Myofiber Bildung kann durch den Übertragungskanal überwacht werden.
3. Bilder von 16-Bit- und 1.024 x 1.024 Pixel pro Bild alle 6 min. 16 h zu erwerben. Für jede erworbene Position eine multiframe.tif-Datei erzeugen (siehe Beispiel in der Zusätzlichen Dateien).
   Hinweis: Dieses Protokoll ist kommerzieller Software, verbunden mit dem Mikroskop (Table of Materials) benutzt worden; Verwenden Sie die entsprechende Software, um das gleiche Ziel zu erreichen, wenn andere Mikroskope mit.
4. Laden Sie die Software als eine ZIP- Datei zusätzlichezur Verfügung gestellt.
   Hinweis: Die Routinen sind Skripte, die in MATLAB ausgeführt werden müssen. Die Software ist eine Adaption eines veröffentlichte Software¹² optimiert für das Tracking der Kerne bei Myotube Bildung. Diese Software ist in zwei Teile geteilt: das erste man identifiziert die Kerne in jedem Frame durch Segmentieren sie, während die zweite "Tracks" (Trajektorien) von Kernen Bewegung erzeugt. Der vollständige Code für nukleare Segmentierung und Tracking und eine schrittweise Anleitung zum Einstieg sind in den Zusätzlichen Dateienzur Verfügung gestellt.
5. Entpacken Sie die Zipdatei und speichern Sie sie in einen gewünschten Pfad auf den heimischen Computer (PC) im Einsatz. Führen Sie alle die folgenden Passagen auf einem PC mit der notwendigen Software bereits installiert. Beachten Sie, dass die ZIP-Datei besteht aus drei Ordner, wie weiter unten erwaehnt.
   Hinweis: Segmentierung Routinen enthält die Funktionen für die Segmentierung ausgeführt werden. Tracking-Routinenenthält stattdessen notwendigen Funktionen für das Tracking. Tracking-Beispiel Segmentierung bietet grundlegende Skripte und Dateien mit dem System vertraut zu machen. Die Software verwendet für die Segmentierung und Verfolgung von den Kernen läuft einwandfrei in MATLAB, R2015a oder spätere Versionen.
6. Um die Kerne aus der TIF-Datei zu segmentieren, benennen Sie die Datei, z. B. NameFile.tif.
   1. Öffnen Sie die Beispiel Segmentierung Tracking -Ordner, und klicken Sie auf DoSegmentation.m. Dies öffnet das Befehlsfenster in MATLAB.
   2. Überprüfen Sie die Aktuellen Ordnerfenster auf der linken Seite zu sehen, alle Elemente im Ordner " Beispiel der Segmentierung Tracking ". Doppelklicken Sie auf DoSegmentation.m.
      Hinweis: Detaillierte Informationen über die Änderungen, die im Skript erfolgen finden Sie in der Datei StepbyStep.txt. Es ist zwingend erforderlich, um das Skript zu ändern, so dass die Variable Filenameinput NameFile.tif und Folderinput ist der Ordner, wo die TIF-Datei enthalten ist.
   3. Führen Sie das Skript (durch einen Klick auf die grüne Schaltfläche " Ausführen "). Das Ergebnis der Segmentierung wird als eine file.mat (SegmentedNameFile.mat), gespeichert werden, während die Segmentierung der Kerne in der Ausgabe Abbildung visualisiert werden kann.
      Hinweis: Parameter für die Segmentierung, beschrieben in dem Skript können bei Bedarf geändert werden. Die Qualität der Segmentierung kann überprüft werden, mit dem Skript CheckSegmentation.m (siehe die StepbyStep.txt-Datei). Auf dieser Grundlage, wenn die Qualität der Segmentierung schlecht ist (nur ein paar Kerne erkannt), passen Sie die Parameter der Segmentierung, deutlich im DoSegmentation.m Skript, und wiederholen Sie den Vorgang.
7. Um die Tracks (d. h. die Flugbahnen der einzelnen Kerne in der Zeit) zu erzeugen, mit den nuklearen Positionen in der Segmentierung erhalten das Skript GenerateTracks.m in denselben Arbeitsordner. Achten Sie darauf, die richtige Segmentierung Datei als Eingabe hinzufügen erhaltenen vor (siehe die StepbyStep.txt-Datei für weitere Informationen).
   Hinweis: Als Ausgang, erhält der Benutzer eine Datei TrackedNameFile.mat, mit einer Matrix für die X-Koordinaten und einer anderen Matrix für die y-Koordinaten der generierten Tracks.
8. Bewertung der Qualität der Titel mit CheckTracking.m (siehe die StepbyStep.txt-Datei für weitere Informationen). Mithilfe der Ausgabe Abbildung dieser letzten Passage jede Position der Kerne in der Zeit zu visualisieren. Überprüfen Sie auf der linken Seite für grüne Kreuze, die jeder segmentierten Kern angeben. Um einen bestimmten Kern auszuwählen, verwenden Sie die untere Bildlaufleiste. Beachten Sie, dass der ausgewählten Kern eingekreist werden in rot, während auf der rechten Seite die Flugbahn der markierten Zelle kann gefolgt werden rechtzeitig (über der oberen Scrollbar).

Ergebnisse

AKW-Bewegung automatisch während Myoblast Differenzierung in der live-Bildgebung zu folgen, sollte die Kerne bevorzugt Eindringmittel beschriftet werden. Es ist wichtig zu beachten, dass mit verschuppen DNA-Moleküle nicht machbar ist, da diese Moleküle die Proliferation und Differenzierung von primären Myoblasten¹³stören. Als Beispiel wurden Proliferation und Differenzierung in primären Myoblasten kultiviert, mit oder ohne Hoechst (Abbild...

Diskussion

Muskelfasern (Myofibers) sind mehrkernigen Zellen, die gebildet werden, durch die Fusion von Vorstufen Muskelzellen (Myoblasten) abgeleitet von Muskelstammzellen (Satelliten-Zellen), die Proliferation und Differenzierung^{2,3unterzogen werden, 4}. Um Myoblast Differenzierung zu beurteilen, besteht das gemeinsame Verfahren der Myoblasten in Medium zu unterscheiden und Fixierung der Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten durchzuführen...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
chicken embryos extract	Seralab	CE-650-J
collagenase	Sigma	C9263-1G	125units/mg
collagen from calf skin	Sigma	C8919
dispase	Gibco	17105-041	1.78 units/mg
doxyciclin	Sigma	D1515
DMEM	Sigma	D5671
fetal bovine serum	Life technologies	10270106
gentamicin	Sigma	G1397
Horse serum	Invitrogen	16050-098
Hoechst	life technologies	33342
IMDM	Sigma	I3390
L-glutamine	Sigma	G7513
Matrigel	Corning	356231
penicillin-streptomycin	Sigma	P0781
red blood cells lysis medium	Biolegend	420301
Digestion medium
collagenase	40 mg
dispase	70 mg
PBS	20 ml
filtered 0.22um
Blocking medium
DMEM
Fetal bovine serum	10%
L-glutammine	1%
penicillin-streptomycin	1%
gentamicin	1 ‰
filtered 0.22um
proliferation medium
IMDM
Fetal bovine serum	20%
L-glutammine	1%
penicillin-streptomycin	1%
gentamicin	1 ‰
chichen embryo extract	3%
filtered 0.22um
differentiation medium
IMDM
Horse serum	2%
L-glutammine	1%
penicillin-streptomycin	1%
gentamicin	1 ‰
chichen embryo extract	1%
filtered 0.22um