小鼠视网膜冷冻节的制备,用于免疫性植物化学

摘要

本报告介绍了制备冷冻小鼠视网膜部分用于免疫组织化学(IHC)的综合方法。 所述方法包括眼部后杯的解剖、甲醛固定、嵌入最佳切割温度(OCT)介质和组织定向、切片和免疫染色。

摘要

为免疫组织化学 (IHC) 制备高质量的小鼠眼部部分对于评估视网膜结构和功能以及确定视网膜疾病背后的机制至关重要。在整个组织制备过程中保持结构完整性对于获得可重复的视网膜 IHC 数据至关重要,但由于视网膜细胞结构的脆弱性和复杂性,这些数据可能具有挑战性。强固定剂,如10%形式蛋白或布恩的溶液,以最佳方式保持视网膜结构,它们通常通过增强背景荧光和/或减少抗体-表位相互作用(称为表位掩蔽的过程)来阻碍IHC分析。另一方面,较温和的固定剂,如4%的甲醛,减少背景荧光和表位遮蔽,必须采用细致的解剖技术来保持视网膜结构。在本文中,我们将介绍一种为 IHC 制备小鼠眼后杯的综合方法,该方法足以保留大多数抗体-表皮相互作用,而不会损失视网膜结构完整性。我们包括具有代表性的IHC与抗体的各种视网膜细胞类型标记,以说明组织保存和方向在最佳和次优条件下。我们的目标是通过提供从眼后杯解剖到IHC的完整方案来优化视网膜的IHC研究。

引言

免疫组织化学(IHC)是一种强大的技术,用于在原位1、2、3定位组织的特定蛋白质和细胞结构。不适当的固定方法和复杂组织的次优切片可能会破坏组织结构,产生高背景染色或减少抗体-表皮相互作用,导致染色伪影,进而造成对IHC 数据⁴.由于脊椎动物视网膜是一种复杂且高度组织的神经器官,由相互连接的光受体、内神经细胞和神经细胞层组成,因此非常脆弱,在解剖和切片过程中很容易被破坏。从小鼠眼部解剖和定向到免疫染色的详细、标准化和经过验证的协议将有助于显著减少 IHC 伪影,从而提高结果的可靠性,并允许获得更准确的比较数据分析。

IHC的组织制备有许多方案,但是,并非所有方案都适合视网膜组织。强固定剂,如10%正式或布因的解决方案保留视网膜结构在解剖和切片5。不幸的是,由于表^位6的化学修饰,强固定剂往往导致增强的背景荧光和表位掩蔽。另一方面,温和的固定剂,如4%的甲醛(PFA)可以减轻其中一些伪影,但需要细致的解剖和切片,以保持最佳的视网膜结构。PFA 迅速穿透组织,但交叉链接蛋白质非常缓慢,降低了表位掩蔽的风险。由于短时间的PFA孵育是一种相对温和的固定,组织往往需要快速冷冻,以保持抗原。在组织冻结期间避免冰晶形成是很重要的,因为它们会扭曲和损害细胞和组织的完整性7。

在这里,我们描述了用于小鼠眼后杯解剖、固定和冷冻保护的详细和标准化协议,这些电池杯可生成一致可靠的 IHC 数据。

研究方案

此处描述的所有方法都是严格按照国家卫生研究院《实验室动物护理和使用指南》中的建议进行的,并经宾夕法尼亚大学动物护理和使用机构委员会。

方法的所有工具和设备如图1所示,并列在材料表中。

1 .小鼠眼联、眼杯解剖和嵌入

1. 用二氧化碳(CO2)对小鼠实施安乐死,然后斩首(产后小鼠P0 - P11)或宫颈脱位(成人>P11小鼠)。对于P0-P14小鼠,眼睛被皮肤覆盖。确保在后续步骤之前取下皮肤。
2. 用尾部烧灼剂轻微灼伤角膜,标记眼睛的时态部分(图2A)。避免在角膜上燃烧一个洞,轻轻触摸角膜,用烧灼器不超过一瞬间。
3. 立即用弯曲的杜蒙特#5/45钳子将鼠标眼睛联结在一起。在1.5 mL冷冻管中孵育15分钟,在冰上的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中孵育1mL至4%的甲醛(PFA)。
4. 在 4% PFA 中 15 分钟后,使用弯曲的钳子 Dumont #5/45 将固定眼转移到经过修改的 35 mm 解剖盘(参见材料表和图 1C)中填充 PBS 并置于解剖显微镜下。
5. 在烧伤标记处做一个小切口,垂直于边缘(角膜边界)上方。
6. 将弯曲的剪刀插入切口,并在边缘后对角膜进行圆周切割(图2B)。
7. 取出角膜,用薄薄的杜蒙特#5钳子(图2B)取出角膜,并小心翼翼地将其从眼睛的后半部分提起。视网膜体,填充镜头和视网膜之间的空间的透明凝胶,将随着透镜(图2B)出现,视网膜将作为覆盖后眼杯内侧的白色表面可见。确保视网膜没有明显损伤,如孔洞或撕裂(图2C)。
8. 在室温下,在 1 mL 的 PBS 中洗眼杯两次 10 分钟。
9. 在 PBS 中,在 4°C 下过夜 15% 蔗糖溶液中,直到眼杯下沉,从而保护眼杯
10. 将眼杯转移到 PBS 中的 30% 蔗糖 2-3 小时,直到眼杯下沉。
11. 将眼杯嵌入 OCT 中,以 10 x 10 mm 的低温(图 3A)。使用解剖显微镜,通过旋转眼睛,直到烧伤标记位于顶部,视神经位于左侧,模具的切口部分朝右(右侧),将眼睛定向到低温中(图 2D,图 3A)图 2D。小心避免组织附近的气泡。
    注:要操纵眼罩,请使用由连接到移液器尖端的钛线制成的钛探头。
12. 要快速冷冻视网膜组织,将冷冻液浸泡在含有丙烯的金属烧杯中至少 5 分钟,并将烧杯放入液氮或干冰/100% 乙醇浴中(高达金属烧杯高度的 1/3)。
    注:低温应浸入丙烯中,使其高度大于其高度的一半,但不必完全浸没。
13. 取出冷冻块,将其包裹在铝箔中。
14. 储存在-80°C。
15. 使用笔或锐化标记冻结块以记录块的方向(图 3B)。

2 .使用低温分段

1. 调整低温温度(-20至-25°C)后,让含有嵌入式眼杯的模具与低温温度平衡1小时。
2. 安装带双体方向的块(图3C),并切割10μm厚的串行部分。小心地将视网膜部分放在带分号和编号的显微镜幻灯片上。
3. 将幻灯片存放在 -20 °C 或 -80 °C 的滑动盒中,直到 IHC 程序。

3 .使用滑动机架进行荧光免疫染色

注: 滑动机架系统(例如,Sequenza)用盖板固定玻璃显微镜滑块,在滑轨和板之间形成 ±100 μL 毛细管间隙。

1. 在室温 (RT) 下将冷冻部分解冻 2 小时至 4 小时,使其干燥并附着在显微镜玻片上。
   注:也可在30-37°C干燥30分钟至1小时。
2. 将幻灯片放在滑动架中,在 100-200 μL PBS 中清洗视网膜部分两次,2 分钟。
3. 通过在 PBS 中孵育视网膜部分 0.25% Triton-X / 0.05% NaN 3,在 RT 中孵育 5 分钟,从而渗透视网膜部分。
4. 向幻灯片添加 100 μL 的阻止溶液。
5. 在阻滞溶液中加入100μL的原抗体,以阻隔溶液加入幻灯片。
6. 在4°C下孵育视网膜部分过夜。
   注: 在此期间,请盖上滑轨机架,以避免部分干燥。
7. 使用 200 μL PBS 洗涤视网膜部分 3 次,每次 15 分钟。
   注: 在 PBS (PBS-T) 中加入 0.001- 0.002% Triton-X100 允许更严格的洗涤,但可能会破坏某些膜和细胞结构。
8. 在荧光标记的二级抗体中孵育视网膜部分1小时,在RT。从现在开始,保护免受光。
9. 洗视网膜部分3次,每次15分钟。
10. 使用热标(如 Hoechst 33342 或 DAPI 溶液)在 RT 孵育视网膜部分 5 分钟。
11. 洗视网膜部分1次15分钟。
12. 在实验室工作台上放置纸巾盖玻片。
13. 将 2 滴防褪色安装介质添加到盖玻片的中心。
14. 将滑轨翻过来,使视网膜低温部分朝下。
15. 小心地以 [45°]角缓慢地将盖玻片安装到安装介质上。
    注:在将幻灯片降至位时,请避免形成气泡。
16. 使用重书或目录(见下文)对滑盖滑片组合施加均匀压力,以消除过多的安装介质。
    注:为确保样品制备的一致性,始终使用相同的对象(即同一书籍或目录)在滑动安装过程中对盖玻片施加均匀压力。
17. 保持平放,让在黑暗中在RT处硬化过夜。无限期地将幻灯片平放在 4°C 下。
18. 通过宽场或共聚焦荧光显微镜成像(图4)。

结果

为了说明这些协议如何,确保IHC的最佳视网膜保存,我们用对红斑素(光受体标记物)8、谷氨酸酸脱碳酶65(Gad65,一种丙烯细胞)的抗体对P28 WT小鼠(C57BL/6N)的视网膜部分进行了调查标记)⁹, 谷氨酰胺合成酶 (GS, Müller 细胞标记)^10,和钙化素 (水平细胞标记)¹¹ (图 4)。IHC 表明我们的协议始终能...

讨论

由于小鼠眼睛的体积和形状小,视网膜易碎,小鼠视网膜解剖是一个微妙的过程。尽管进行高质量的解剖是一个实践问题,但拥有详细的协议,提供有效的方法和提示是获得视网膜部分和IHC的必要条件。除了此处介绍的协议外,还有几个提示允许一致的高质量视网膜部分,适用于可重复的 IHC。

在开始解剖之前,重要的是要舒适,放松,并设置房间照明,以在小鼠眼睛微解剖的最佳视力。为...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
6qt. Stainless Steel Beaker (185 x 218mm)	Gilson	#MA-48	For liquid nitrogen (Figure 1E)
Aluminum foil
Cauterizer	Bovie	#AA01	To mark eye orientation (Figure 1A)
Curved forceps, Dumont #5/45 tweezers, 45-degrees bent	Electron Microscopy Sciences	#72703-D	For mouse eye enucleation and maintenance (Figure 1A)
Curved scissors, Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge	Fine Science Tools	#15002-08	To circumferentially cut the cornea (Figure 1B)
Dental wax-coated 35mm dissection dish			For eye cup dissection (Figure 1C)
Dissecting microscope	Leica, Houston, USA	MZ12.5 High-performance stereomicroscope
Micro Knives - Plastic Handle	Fine Science Tools	#10315-12	To make a small incision at the burn mark (Figure 1A)
Pink dental wax	Electron Microscopy Sciences	#72660	For coating dissection dish
Slide Rack and Coverplate	Ted Pella	#36107	For retinal IHC (Figure 1G)
Stainless Steel Beaker (89 x 114mm)	Gilson	#MA-40	For isopentane bath (Figure 1E)
Styrofoam box			For insulated cooler
Thin forceps Dumont #5	Fine Science Tools	#11254-20	To remove the cornea and extract the lens (Figure 1B)
Tissue-Tek cryomold  (10mm x 10mm x 5mm)	Electron Miscroscopy Sciences	#62534-10	Mold for OCT embedding
Buffers and Reagents	Company	Catalog Number	Comments
Blocking solution			2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in permeabilization buffer.
Gelvatol (anti-fading mounting media)			Under the fume hood, dissolve 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01).  Adjust to pH 8-8.5 with 12N HCl (~ 5 drops).  Store in amber drop bottle at 4°C  (8).
Hoechst 33342 1000x Stock	Thermo Scientific	#62249	1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquot and store in dark, at 4°C for up to 1 year or at -20°C for long term storage. Prepare fresh  at 1 ug/mL (1x)
Isopentane, 99%	GFS Chemicals	#2961
Liquid Nitrogen
Paraformaldehyde (PFA) in PBS	Electron Microscopy Sciences	#15710	Prepared fresh 4% PFA from 16% PFA stock. Store the remaining 16% PFA at 4°C in the dark.
Permeabilization solution			PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3.  Prepare fresh.
Phosphate-buffered saline (PBS)	Bioworld	#41620015-20	0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4.  Prepared from 10x stock
Sucrose solutions	Fisher Scientific	#S-5-500	Dissolve the appropriate amount of sucrose in  37°C PBS (takes ~15 min to dissolve). May be stored for a few days at 4°C.
Tissue-Tek OCT-compound	Sakura	#4583
Antibodies	Company	Catalog Number	Comments
anti-calbindin	Sigma-Aldrich	C8666	To label horinzotal cells
anti-GAD65	Chemicon	AB5082	To label GABAergic amacrine cells
anti-GS	BD Transduction	610517	To label Müller cells
anti-rhodopsin	Millipore	MAB5316	To label rods