Vorbereitung von Maus-Retinal-Cryo-Sektionen für die Immunhistochemie

Zusammenfassung

Dieser Bericht beschreibt umfassende Methoden zur Vorbereitung von gefrorenen Mausnetzteilen für die Immunhistochemie (IHC). Die beschriebenen Methoden umfassen die Zerlegung des okularen posterioren Bechers, die Paraformaldehydfixierung, die Einbettung in die Medien der optimalen Schnitttemperatur (OCT) und die Gewebeorientierung, die Schnitt- und Immunfärbung.

Zusammenfassung

Die Vorbereitung hochwertiger Mausaugenabschnitte für die Immunhistochemie (IHC) ist entscheidend für die Beurteilung der Netzhautstruktur und -funktion und für die Bestimmung der Mechanismen, die Netzhauterkrankungen zugrunde liegen. Die Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität während der gesamten Gewebepräparation ist für die Gewinnung reproduzierbarer retinaler IHC-Daten von entscheidender Bedeutung, kann aber aufgrund der Fragilität und Komplexität der retinalen Zytoarchitektur eine Herausforderung darstellen. Starke Fixative wie 10% Formalin oder Bouins Lösung bewahren die Netzhautstruktur optimal, sie behindern oft die IHC-Analyse, indem sie die Hintergrundfluoreszenz und/oder die abnehmenden Antikörper-Epitop-Wechselwirkungen verbessern, ein Prozess, der als Epitopmaskierung bekannt ist. Milderfixative hingegen, wie 4% Paraformaldehyd, reduziert Die Hintergrundfluoreszenz und Epitopmaskierung, sorgfältige Seziertechniken müssen verwendet werden, um die Netzhautstruktur zu erhalten. In diesem Artikel stellen wir eine umfassende Methode zur Vorbereitung von Maus-Okularbechern für IHC vor, die ausreicht, um die meisten Antikörper-Epitop-Wechselwirkungen ohne Verlust der strukturellen Integrität der Netzhaut zu erhalten. Wir schließen repräsentative IHC mit Antikörpern gegen verschiedene Netzhautzelltypmarker ein, um die Gewebeerhaltung und -orientierung unter optimalen und suboptimalen Bedingungen zu veranschaulichen. Unser Ziel ist es, IHC-Studien der Netzhaut zu optimieren, indem wir ein komplettes Protokoll von der okularen hinteren Bechersektion bis zum IHC bereitstellen.

Einleitung

Immunohistochemistry (IHC) ist eine leistungsfähige Technik zur Lokalisierung spezifischer Proteine und zellulärer Strukturen in Geweben in situ^1,2,3. Ungeeignete Fixierungsmethoden und suboptimale Schnitte komplexer Gewebe können die Gewebestruktur stören, eine hohe Hintergrundfärbung erzeugen oder Antikörper-Epitop-Wechselwirkungen verringern, was zu Färbeartefakten und daraus resultierender Fehlinterpretation von IHC-Daten⁴. Da die Netzhaut des Wirbeltiers ein komplexes und hochorganisiertes neuronales Organ ist, das aus Schichten miteinander verbundener Photorezeptoren, Interneuroner und Ganglienzellen besteht, ist es sehr zerbrechlich und kann leicht während der Zerlegung und Schnitte gestört werden. Ein detailliertes, standardisiertes und validiertes Protokoll von der Mausaugensektion und -orientierung bis zur Immunfärbung wird dazu beitragen, IHC-Artefakte deutlich zu reduzieren, wodurch die Zuverlässigkeit der Ergebnisse erhöht und genauere Vergleichsdaten möglich sind. analyse.

Es gibt viele Protokolle für die Gewebevorbereitung für IHC, jedoch sind nicht alle für Netzhautgewebe geeignet. Starke Fixative wie 10% Formalin oder Bouin-Lösung bewahren die Netzhautstruktur während der Zerlegung und Schnittung⁵. Leider führen starke Fixative oft zur verstärkten Hintergrundfluoreszenz und Epitopmaskierung aufgrund der chemischen Modifikation von Epitopen⁶. Auf der anderen Seite können mildere Fixative, wie 4% Paraformaldehyd (PFA), einige dieser Artefakte lindern, erfordern aber eine sorgfältige Zerlegung und Schnitte, um die optimale Netzhautstruktur zu erhalten. PFA dringt schnell in Gewebe ein, aber Kreuz-Links-Proteine sehr langsam, wodurch das Risiko der Epitopmaskierung reduziert wird. Da die PFA-Inkubation in kurzer Zeit eine relativ milde Fixierung ist, benötigen Gewebe oft schnelles Einfrieren, um Antigene zu erhalten. Es ist wichtig, die Bildung von Eiskristallen beim Einfrieren des Gewebes zu vermeiden, da sie die Integrität von Zellen und Geweben verzerren und schädigen⁷.

Hier beschreiben wir detaillierte und standardisierte Protokolle für Sezieren, Fixierung und Kryoschutz von Maus-Okularbechern, die konsistente und zuverlässige IHC-Daten liefern.

Protokoll

Alle hier beschriebenen Methoden wurden in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen des National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals durchgeführt, der vom Institut für Labortierressourcen zur Verfügung gestellt wurde, und wurden von der Institutional Animal Care and Use Committee der University of Pennsylvania.

Alle Werkzeuge und Geräte für die Methoden sind in Abbildung 1 dargestellt und in der Tabelle der Materialienaufgeführt.

1 . Mausaugenenukleation, Augenbechersezieren und Einbetten

1. Euthanisieren Sie Mäuse mitKohlendioxid (CO2 ), gefolgt von enthaupteten (postnatale Mäuse P0 - P11) oder zervikale Dislokation (Erwachsene >P11 Mäuse). Bei P0-P14-Mäusen sind die Augen von Haut bedeckt. Stellen Sie sicher, dass die Haut vor den nachfolgenden Schritten entfernt wird.
2. Markieren Sie den zeitlichen Teil des Auges (Abbildung 2A), indem Sie die Hornhaut leicht mit einem Schwanzkauterisierer verbrennen. Vermeiden Sie es, ein Loch in der Hornhaut zu verbrennen, indem Sie die Hornhaut sehr leicht und für nicht mehr als eine Sekunde mit dem Kauterizer berühren.
3. Entführen Sie sofort Mausaugen mit gebogenen Dumont #5/45 Zangen. 15 min in einem 1,5 ml Kryoröhrenrohr mit 1 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) in phosphatgepufferter Salin (PBS) auf Eis inkubieren.
4. Nach 15 min in 4% PFA das fixierte Auge mit den gekrümmten Zangen Dumont #5/45 auf eine modifizierte 35 mm Sezierschale (siehe Materialtabelle und Abbildung 1C) mit PBS gefüllt und unter sezierendes Mikroskop platzieren.
5. Machen Sie einen kleinen Schnitt an der Brennzeichen, senkrecht zu und knapp über dem Limbus (Grenze der Hornhaut) mit dem Mikromesser.
6. Setzen Sie die gekrümmte Schere in den Schnitt ein und führen Sie einen Umfangsschnitt der Hornhaut nach dem Limbus durch (Abbildung 2B).
7. Entfernen Sie die Hornhaut und extrahieren Sie die Linse mit einem dünnen Dumont #5 Zange , (Abbildung 2B) und heben Sie es zart weg von der hinteren Teil des Auges. Der Glaskörper, das klare Gel, das den Raum zwischen der Linse und der Netzhaut füllt, wird mit der Linse herauskommen (Abbildung 2B) und die Netzhaut wird als weiße Oberfläche sichtbar sein, die die Innenseite der hinteren Augentasse bedeckt. Stellen Sie sicher, dass keine sichtbaren Schäden an der Netzhaut, wie Löcher oder Risse (Abbildung 2C) vorhanden sind.
8. Waschen Sie die Augenbecher zweimal in 1 ml PBS für 10 min bei Raumtemperatur.
9. Kryoschützen Sie die Augenbecher, indem Sie sie in einer Lösung von 15% Saccharose in PBS über Nacht bei 4 °C ausgrenzen, bis die Augentasse sinkt
10. Übertragen Sie die Augenbecher auf 30% Saccharose in PBS für 2-3 h, bis die Augentasse sinkt.
11. Die Augenmuscheln in OCT in 10 x 10 mm Kryomolden einbetten (Abbildung 3A). Mit einem Sezieren Mikroskop, orientieren Sie das Auge in der Kryomold entlang seiner dorsal-ventralen Achse (Abbildung 2D, Abbildung 3A) durch Drehen des Auges, bis die Brandmarke auf der Oberseite ist, der Sehnerv ist auf der linken Seite und der ausgeschnittene Teil der Form zeigt sich nach rechts ( Abbildung 2D). Achten Sie darauf, Blasen in der Nähe des Gewebes zu vermeiden.
    HINWEIS: Um den Augenbecher zu manipulieren, verwenden Sie eine Titansonde aus einem Titandraht, der an einer Pipettenspitze befestigt ist.
12. Um Netzhautgewebe zu einfrieren, tauchen Sie den Kryomold mindestens 5 min in ein Metallbecher mit Isopentan ein und legen Sie das Becherglas in flüssigen Stickstoff oder Trockeneis/100% Ethanolbad (bis zu 1/3 der Höhe des Metallbechers).
    HINWEIS: Der Kryomold sollte in Isopentan emittan e,Isopentane bis zur Hälfte seiner Höhe eingetaucht werden, muss aber nicht vollständig untergetaucht werden.
13. Entfernen Sie den gefrorenen Block und wickeln Sie ihn in Aluminiumfolie.
14. Bei -80 °C lagern.
15. Markieren Sie den eingefrorenen Block mit einem Stift oder Sharpie, um die Ausrichtung des Blocks aufzuzeichnen (Abbildung 3B).

2 . Schnitt mit einem Kryostat

1. Nach der Einstellung der Kryostattemperatur (zwischen -20 und -25 °C) lassen Sie die Formen, die die eingebetteten Augenbecher enthalten, 1 h auf die Kryostattemperatur ausgrenzen.
2. Installieren Sie den Block mit dorso-ventraler Ausrichtung (Abbildung 3C) und schneiden Sie 10 m dicke serielle Abschnitte. Platzieren Sie die Netzhautabschnitte vorsichtig auf kommentierten und nummerierten Mikroskopdias.
3. Lagern Sie Dias in Diaboxen bei -20 °C oder -80 °C, bis IHC-Verfahren durchgeführt werden.

3 . Fluoreszenz-Immunostainierung mit dem Slide Rack

HINWEIS: Das Slide Rack-System (z. B. Sequenza) hält die Glasmikroskop-Dias mit einer Abdeckplatte, wodurch ein Kapillarspalt von 100 L zwischen dem Schlitten und der Platte entsteht.

1. Die Kryo-Sektionen bei Raumtemperatur (RT) für 2 h bis 4 h auftauen, damit sie trocknen und an Mikroskopschlitten befestigen können.
   HINWEIS: Es ist auch möglich, sie bei 30-37 °C für 30 min bis 1 h zu trocknen.
2. Legen Sie Dias in Slide Rack und waschen Sie die Netzhautabschnitte zweimal in 100-200 L PBS für 2 min.
3. Permeabilisieren Sie die Netzhautabschnitte, indem Sie sie in 0,25% Triton-X / 0,05% NaN₃in PBS für 5 min bei RT inkubieren.
4. Fügen Sie den Folien eine Blockierlösung mit 100 L hinzu.
5. Fügen Sie den Dias 100 L primärer Antikörper hinzu, der in einer Blockierenden Lösung verdünnt wird.
6. Retinalabschnitte über Nacht bei 4 °C inkubieren.
   HINWEIS: Während dieser Zeit decken Sie das Slide Rack ab, um eine Austrocknung der Abschnitte zu vermeiden.
7. Waschen Sie die Netzhautabschnitte 3 Mal, jeweils für 15 min, mit 200 L PBS.
   HINWEIS: Die Zugabe von 0,001- 0,002% Triton-X100 zu PBS (PBS-T) ermöglicht eine strengere Wäsche, kann aber einige Membranen und zelluläre Strukturen stören.
8. Inkubieren Sie Netzhautabschnitte in fluoreszierend-markierten sekundären Antikörpern für 1 h bei RT. Von nun an vor Licht schützen.
9. Waschen Sie die Netzhautabschnitte 3 mal, jeweils für 15 min.
10. Inkubieren Sie die Netzhautabschnitte bei RT für 5 min mit einem Kernmarker wie Hoechst 33342 oder DAPI-Lösung.
11. Waschen Sie die Netzhautabschnitte 1 Mal für 15 min.
12. Legen Sie einen Deckelaufschlag auf ein Papiertuch auf die Laborbank.
13. Fügen Sie 2 Tropfen anti-fading Montagemedien in die Mitte des Coverslip.
14. Drehen Sie die Rutsche um, um den Retina-Kryo-Abschnitt nach unten zu haben.
15. Montieren Sie den Deckelrutsch vorsichtig langsam, in einem Winkel von 45°, kippen Sie den Schlitten auf das Montagemedium.
    HINWEIS: Vermeiden Sie das Bilden von Blasen, wenn Sie die Folie an Ort und Stelle senken.
16. Tragen Sie mit einem schweren Buch oder Katalog (siehe unten) gleichmäßigen Druck auf die Slide-Coverslip-Kombination, um überschüssige Montagemedien zu vermeiden.
    HINWEIS: Um die Konsistenz bei der Probenvorbereitung zu gewährleisten, verwenden Sie immer dasselbe Objekt (d. h. dasselbe Buch oder denselben Katalog), um während der Schiebemontage gleichmäßigen Druck auf den Deckelzuschlag auszuüben.
17. Flach halten und bei RT im Dunkeln über Nacht aushärten lassen. Dias bei 4 °C auf unbestimmte Zeit flach lagern.
18. Bild über Weitfeld- oder konfokale Fluoreszenzmikroskopie (Abbildung 4).

Ergebnisse

Um zu veranschaulichen, wie diese Protokolle eine optimale Netzhautkonservierung für IHC gewährleisten, untersuchten wir Netzhautabschnitte von P28 WT-Mäusen (C57BL/6N) mit Antikörpern gegen Rhodopsin (ein Photorezeptormarker)⁸, Glutaminsäure-Decarboxylase 65 (Gad65, eine Marker)⁹, Glutamin-Synthetase (GS, ein Müller-Zellmarker)¹⁰und Calbindin (ein horizontaler Zellmarker)¹¹ (

Diskussion

Maus Netzhaut-Sektion ist ein empfindlicher Prozess aufgrund der geringen Größe und Form der Mausaugen und die Fragilität der Netzhautgewebe. Auch wenn die Durchführung von qualitativ hochwertigen Sezierungen eine Frage der Praxis ist, ist es eine Notwendigkeit, mit einem detaillierten Protokoll effiziente Methoden und Tipps zu erhalten, um Netzhautabschnitte und IHC zu erhalten. Zusätzlich zu den hier beschriebenen Protokollen gibt es einige Tipps, die konsistente hochwertige Netzhautabschnitte ermöglichen, die f?...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
6qt. Stainless Steel Beaker (185 x 218mm)	Gilson	#MA-48	For liquid nitrogen (Figure 1E)
Aluminum foil
Cauterizer	Bovie	#AA01	To mark eye orientation (Figure 1A)
Curved forceps, Dumont #5/45 tweezers, 45-degrees bent	Electron Microscopy Sciences	#72703-D	For mouse eye enucleation and maintenance (Figure 1A)
Curved scissors, Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge	Fine Science Tools	#15002-08	To circumferentially cut the cornea (Figure 1B)
Dental wax-coated 35mm dissection dish			For eye cup dissection (Figure 1C)
Dissecting microscope	Leica, Houston, USA	MZ12.5 High-performance stereomicroscope
Micro Knives - Plastic Handle	Fine Science Tools	#10315-12	To make a small incision at the burn mark (Figure 1A)
Pink dental wax	Electron Microscopy Sciences	#72660	For coating dissection dish
Slide Rack and Coverplate	Ted Pella	#36107	For retinal IHC (Figure 1G)
Stainless Steel Beaker (89 x 114mm)	Gilson	#MA-40	For isopentane bath (Figure 1E)
Styrofoam box			For insulated cooler
Thin forceps Dumont #5	Fine Science Tools	#11254-20	To remove the cornea and extract the lens (Figure 1B)
Tissue-Tek cryomold  (10mm x 10mm x 5mm)	Electron Miscroscopy Sciences	#62534-10	Mold for OCT embedding
Buffers and Reagents	Company	Catalog Number	Comments
Blocking solution			2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in permeabilization buffer.
Gelvatol (anti-fading mounting media)			Under the fume hood, dissolve 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01).  Adjust to pH 8-8.5 with 12N HCl (~ 5 drops).  Store in amber drop bottle at 4°C  (8).
Hoechst 33342 1000x Stock	Thermo Scientific	#62249	1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquot and store in dark, at 4°C for up to 1 year or at -20°C for long term storage. Prepare fresh  at 1 ug/mL (1x)
Isopentane, 99%	GFS Chemicals	#2961
Liquid Nitrogen
Paraformaldehyde (PFA) in PBS	Electron Microscopy Sciences	#15710	Prepared fresh 4% PFA from 16% PFA stock. Store the remaining 16% PFA at 4°C in the dark.
Permeabilization solution			PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3.  Prepare fresh.
Phosphate-buffered saline (PBS)	Bioworld	#41620015-20	0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4.  Prepared from 10x stock
Sucrose solutions	Fisher Scientific	#S-5-500	Dissolve the appropriate amount of sucrose in  37°C PBS (takes ~15 min to dissolve). May be stored for a few days at 4°C.
Tissue-Tek OCT-compound	Sakura	#4583
Antibodies	Company	Catalog Number	Comments
anti-calbindin	Sigma-Aldrich	C8666	To label horinzotal cells
anti-GAD65	Chemicon	AB5082	To label GABAergic amacrine cells
anti-GS	BD Transduction	610517	To label Müller cells
anti-rhodopsin	Millipore	MAB5316	To label rods