免疫組織化学用マウスレチンクライオ切片の調製

要約

本報告では、免疫組織化学(IHC)のための凍結マウス網膜切片を準備するための包括的な方法について説明する。 記載された方法は、眼後カップの解剖、パラホルムアルデヒド固定、最適切断温度(OCT)培媒体および組織配向への埋め込み、断断および免疫染色を含む。

要約

免疫組織化学(IHC)のための高品質のマウス眼科の準備は、再生体の構造と機能を評価し、および再生疾患の根底にあるメカニズムを決定するために重要です。組織の調製全体を通じて構造的完全性を維持することは、再現可能な再生可能な再生IHCデータを得るために不可欠ですが、再生細胞構造の脆弱性と複雑さのために困難な場合があります。10%ホルマリンまたはBouinの溶液のような強力な固定剤は、尾膜構造を最適に保存し、それらはしばしば背景蛍光および/または減少する抗体エピトープ相互作用を増強することによってIHC分析を妨げる、エピトープマスキングとして知られているプロセスである。一方、穏やかな固定剤は、4%パラホルムアルデヒドのように、背景蛍光およびエピトープマスキングを減少させ、細心の注意を払って解剖技術を利用して、尾膜構造を維持しなければならない。本稿では、網膜構造完全性を損なうことなく、ほとんどの抗体エピトープ相互作用を維持するのに十分なIHC用マウス眼後カップを調製する包括的な方法を提示する。我々は、最適かつ最適でない条件下で組織の保存と向きを示すために、様々な再生細胞型マーカーに対する抗体を有する代表的なIHCを含む。私たちの目標は、眼後カップ解剖からIHCへの完全なプロトコルを提供することにより、網膜のIHC研究を最適化することです。

概要

免疫組織化学(IHC)は、その中の組織における特定のタンパク質および細胞構造を局所化するための強力な技術である1,^2,3.複雑な組織の不適切な固定方法と最適でない断面は、組織構造を破壊し、高いバックグラウンド染色を生成したり、抗体エピトープ相互作用を減少させたり、染色アーティファクトおよび結果的に誤解を招く可能性があります。IHC データ⁴.脊椎動物網膜は、相互接続された光受容体、インターニューロンおよび神経節細胞の層から構成される複雑で高度に組織化された神経器官であり、非常に壊れやすく、解剖および切断中に容易に破壊されうる。マウスの眼の解剖とオリエンテーションから免疫染色までの詳細で標準化された検証済みのプロトコルは、IHCアーティファクトを大幅に削減し、結果の信頼性を高め、より正確な比較データを可能にします。分析。

IHCの組織調製のための多くのプロトコルがありますが、すべてがリニア組織に適しているわけではありません。10%ホルマリンやBouinの溶液のような強力な固定剤は、解剖および断面5の間に尾膜構造を保持する。残念ながら、強力な固定剤は、多くの場合、エピトープ6の化学修飾による強化された背景蛍光およびエピトープマスキングにつながる。一方、4%パラホルムアルデヒド(PFA)のような穏やかな固定剤は、これらのアーティファクトの一部を緩和することができますが、最適な尾膜構造を維持するために細心の解剖と断面が必要です。PFAは急速に組織に浸透するが、タンパク質を非常にゆっくりと交差させるので、エピトープマスキングのリスクを低減する。短時間のPFAインキュベーションは比較的軽度の固定であるため、組織はしばしば抗原を保存するために急速な凍結を必要とする。細胞や組織の完全性を歪め、損傷するので、組織凍結中の氷の結晶形成を避けることは重要です⁷.

ここでは、一貫性のある信頼性の高いIHCデータを生み出すマウス眼後カップの解剖、固定、およびクライオ保護のための詳細で標準化されたプロトコルについて説明します。

プロトコル

ここに記載されているすべての方法は、実験動物資源研究所が提供する実験動物のケアと使用に関する国立衛生研究所の勧告に従って厳格に実施され、ペンシルバニア大学の施設動物ケア・使用委員会

この方法のすべてのツールと機器を図 1に示し、材料の表に示します。

1 .マウスの目のエニュレーション、アイカップの解剖、および埋め込み

1. 二酸化炭素(CO2)でマウスを安楽死させ、その後に切断(出生後マウスP0-P11)または子宮頸部脱臼(成人>P11マウス)のいずれかが続く。P0-P14マウスの場合、目は皮膚で覆われています。後続の手順の前に、皮膚を取り除くようにしてください。
2. テール焼灼器を使用して角膜をわずかに燃やして、眼の時間的な部分(図2A)をマークします。角膜に非常に軽く触れ、焼灼器で1秒以下で角膜に穴を開けないようにしてください。
3. 湾曲したデュモン#5/45鉗子を使用して、マウスの目を直ちに取り込みます。1.5 mLのクライオチューブチューブで15分間インキュベートし、1mLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)を氷上のリン酸緩衝生理食液(PBS)でインキュベートします。
4. 4%PFAで15分後、曲面鉗子デュモン#5/45を使用して固定眼をPBSで満たされた修正された35mm解剖皿(材料表および図1Cを参照)に移し、解剖顕微鏡の下に置きます。
5. マイクロナイフを使用して、リム(角膜の境界)に垂直で、ちょうど上の火傷マークで小さな切開を行います。
6. 湾曲したはさみを切開部に挿入し、四肢に続く角膜の円周切り取りを行います(図2B)。
7. 角膜を取り出し、薄いデュモン#5鉗子でレンズを抽出し(図2B)、目の後部から繊細に持ち上げます。レンズと網膜の間の空間を埋める透明なゲルである静脈状体がレンズ(図2B)で出てきて、網膜が後眼カップの内側を覆う白い面として見えます。穴や涙などの網膜に目に見える損傷がないことを確認してください(図2C)。
8. 眼のカップを1mLのPBSで2回、室温で10分間洗います。
9. アイカップが沈むまで4°Cで一晩PBSで15%ショ糖の溶液でそれらを平衡化することにより、眼カップを凍結保護
10. 眼カップが沈むまで2~3時間PBSで30%のショ糖に眼カップを移します。
11. 10 x 10 mm のクライモルドで目のカップを OCT に埋め込みます (図 3A)。解剖顕微鏡を使用して、その背部腹部軸に沿って凍結で目を向けます (図 2D,図3A)火傷マークが上にあるまで目を回転させることによって、視神経が左側にあり、カビの切り取り部分が右側に向きます (図2D)。組織の近くの気泡を避けるために注意してください。
    注:アイカップを操作するには、ピペットチップに取り付けられたチタンワイヤーで作られたチタンプローブを使用します。
12. リネット組織をスナップ凍結するには、イソペンタンを含む金属ビーカーに少なくとも5分間クライモールドを浸し、ビーカーを液体窒素またはドライアイス/100%エタノール浴(金属ビーカーの高さの1/3まで)に入れます。
    注:クライモルドは、その高さの半分以上にイゼンタンに浸漬する必要がありますが、完全に水没する必要はありません。
13. 冷凍ブロックを取り出し、アルミホイルで包みます。
14. -80 °C.で保存します。
15. ペンまたはシャープを使用してフリーズブロックにマークを付け、ブロックの向きを記録します (図 3B)。

2 .クライオスタットを使用した断面

1. クライオスタット温度(-20~-25°C)を調整した後、埋め込まれたアイカップを含む金型を1時間クライオスタット温度に平衡させます。
2. ドーソ通気の向き(図3C)でブロックを取り付け、10μmの厚いシリアルセクションを切断します。注意深くアノンテットと番号付き顕微鏡スライド上に樹脂セクションを配置します。
3. スライドは、IHCの手順まで-20 °Cまたは-80 °Cでスライドボックスに保管してください。

3 .スライドラックを用した蛍光免疫染色

注:スライドラックシステム(例えば、Sequenza)は、カバープレート付きのガラス顕微鏡スライドを保持し、スライドとプレートの間に約100μLの毛細血管ギャップを作成します。

1. 室温(RT)で2時間から4時間凍結切片を解凍し、顕微鏡スライドに乾燥させて取り付けます。
   注:30-37 °Cで30分から1時間乾燥することも可能です。
2. スライドラックにスライドを配置し、100-200 μL PBSで2分間、樹脂片を2回洗浄します。
3. RTで5分間PBSで0.25%トリトン-X/0.05%NaN3でそれらをインキュベートすることにより、再生片を透過化します。
4. スライドに100 μLのブロッキング溶液を追加します。
5. ブロッキング溶液中に希釈した一次抗体を100μLの一次抗体をスライドに添加する。
6. 4°Cで一晩で再生する。
   注: この間、スライド ラックをカバーして、セクションの乾燥を防ぐ。
7. 200 μL PBS を使用して、それぞれ 15 分間、樹脂切り切りを 3 回洗浄します。
   注:0.001- 0.002% トリトンX100をPBS(PBS-T)に添加すると、より厳格な洗浄が可能になりますが、一部の膜や細胞構造を破壊する可能性があります。
8. RTで1時間蛍光標識二次抗体で再生性の再生部。これからは光から守る。
9. 樹脂切片を3回洗い、それぞれ15分間洗います。
10. Hoechst 33342またはDAPI溶液などの核マーカーでRTのレチナルセクションを5分間インキュベートします。
11. 樹脂切片を1回15分間洗います。
12. ラボのベンチにペーパータオルの上にカバースリップを置きます。
13. カバースリップの中心にフェージング防止マウントメディアを2滴追加します。
14. スライドを裏返して、尾道の凍結セクションを下向きにします。
15. カバースリップを慎重に約45°の角度でゆっくりと取り付け、スライドを取り付けメディアに先端にします。
    注: スライドを下げると、バブルの形成を避けてください。
16. 重い本またはカタログ(下記参照)を使用して、余分な取り付けメディアを排除するためにスライドカバースリップの組み合わせに均等な圧力を加えます。
    注:サンプル調製の一貫性を確保するために、スライドの取り付け中にカバースリップに均等な圧力をかけるには、常に同じオブジェクト(同じブックまたはカタログ)を使用してください。
17. 平らに保ち、暗闇の中でRTで一晩硬化させます。スライドを4°Cで無期限に平らに保管してください。
18. 広視野または共焦点蛍光顕微鏡による画像(図4)。

結果

これらのプロトコルを説明するために、IHCに最適な網膜保存を確保するために、我々はロドプシン(光受容体マーカー)8、グルタミン酸デカルボキシラーゼ65(Gad65、アマクリン細胞)に対する抗体を用いてP28 WTマウス(C57BL/6N)から網膜切除を調べた。マーカー)9、グルタミン合成酵素(GS、ミュラー細胞マーカー)10、及びカルビンジン(水平...

ディスカッション

マウス網膜解剖は、マウスの目の小さなサイズと形状と網膜組織の脆弱性による繊細なプロセスです。高品質の解剖を行うことは実践の問題ですが、詳細なプロトコルを持って、効率的な方法とヒントを提供することは、再生部とIHCを得るために必要です。ここで説明するプロトコルに加えて、再現可能な IHC に適した一貫した高品質の整膜セクションを可能にするいくつかのヒントがあり?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
6qt. Stainless Steel Beaker (185 x 218mm)	Gilson	#MA-48	For liquid nitrogen (Figure 1E)
Aluminum foil
Cauterizer	Bovie	#AA01	To mark eye orientation (Figure 1A)
Curved forceps, Dumont #5/45 tweezers, 45-degrees bent	Electron Microscopy Sciences	#72703-D	For mouse eye enucleation and maintenance (Figure 1A)
Curved scissors, Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge	Fine Science Tools	#15002-08	To circumferentially cut the cornea (Figure 1B)
Dental wax-coated 35mm dissection dish			For eye cup dissection (Figure 1C)
Dissecting microscope	Leica, Houston, USA	MZ12.5 High-performance stereomicroscope
Micro Knives - Plastic Handle	Fine Science Tools	#10315-12	To make a small incision at the burn mark (Figure 1A)
Pink dental wax	Electron Microscopy Sciences	#72660	For coating dissection dish
Slide Rack and Coverplate	Ted Pella	#36107	For retinal IHC (Figure 1G)
Stainless Steel Beaker (89 x 114mm)	Gilson	#MA-40	For isopentane bath (Figure 1E)
Styrofoam box			For insulated cooler
Thin forceps Dumont #5	Fine Science Tools	#11254-20	To remove the cornea and extract the lens (Figure 1B)
Tissue-Tek cryomold  (10mm x 10mm x 5mm)	Electron Miscroscopy Sciences	#62534-10	Mold for OCT embedding
Buffers and Reagents	Company	Catalog Number	Comments
Blocking solution			2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in permeabilization buffer.
Gelvatol (anti-fading mounting media)			Under the fume hood, dissolve 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01).  Adjust to pH 8-8.5 with 12N HCl (~ 5 drops).  Store in amber drop bottle at 4°C  (8).
Hoechst 33342 1000x Stock	Thermo Scientific	#62249	1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquot and store in dark, at 4°C for up to 1 year or at -20°C for long term storage. Prepare fresh  at 1 ug/mL (1x)
Isopentane, 99%	GFS Chemicals	#2961
Liquid Nitrogen
Paraformaldehyde (PFA) in PBS	Electron Microscopy Sciences	#15710	Prepared fresh 4% PFA from 16% PFA stock. Store the remaining 16% PFA at 4°C in the dark.
Permeabilization solution			PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3.  Prepare fresh.
Phosphate-buffered saline (PBS)	Bioworld	#41620015-20	0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4.  Prepared from 10x stock
Sucrose solutions	Fisher Scientific	#S-5-500	Dissolve the appropriate amount of sucrose in  37°C PBS (takes ~15 min to dissolve). May be stored for a few days at 4°C.
Tissue-Tek OCT-compound	Sakura	#4583
Antibodies	Company	Catalog Number	Comments
anti-calbindin	Sigma-Aldrich	C8666	To label horinzotal cells
anti-GAD65	Chemicon	AB5082	To label GABAergic amacrine cells
anti-GS	BD Transduction	610517	To label Müller cells
anti-rhodopsin	Millipore	MAB5316	To label rods