면역 조직 화학을 위한 마우스 망막 극저온 단면도 단면도의 준비

요약

이 보고는 면역성 화학을 위한 동결된 마우스 망막 단면도를 준비하기 위한 포괄적인 방법을 기술합니다 (IHC). 설명된 방법은 안구 후방 컵의 해부, 파라포름알데히드 고정, 최적 절삭 온도(OCT) 매체 및 조직 배향에 포함, 단면화 및 면역 염색을 포함한다.

초록

면역 조직 화학 (IHC)를 위한 고품질 마우스 눈 단면도의 준비는 망막 구조물 및 기능을 평가하고 망막 질병의 근본적인 기계장치를 결정하기를 위해 중요합니다. 조직 준비 전반에 걸쳐 구조적 무결성을 유지하는 것은 재현 가능한 망막 IHC 데이터를 얻는 데 필수적이지만 망막 세포아키텍처의 취약성과 복잡성으로 인해 어려울 수 있습니다. 10% 포르말린 또는 Bouin의 용액과 같은 강한 고착제는 망막 구조를 최적으로 보존하며, 종종 배경 형광을 향상시키고 항체-에피토프 상호작용을 감소시킴으로써 IHC 분석을 방해합니다. 온화한 고착제는, 4% 파라포름알데히드와 같이, 배경 형광 및 에피토프 마스킹을 감소시키고, 세심한 해부 기술은 망막 구조물을 보존하기 위하여 이용되어야 합니다. 이 문서에서는, 우리는 망막 구조 무결성의 손실 없이 대부분의 항체 에피토프 상호 작용을 보존하기에 충분한 IHC를 위한 마우스 안구 후방 컵을 준비하는 포괄적인 방법을 제시합니다. 우리는 최적이고 최적이 아닌 조건 하에서 조직 보존 및 방향을 설명하기 위해 다양한 망막 세포 유형 마커에 대한 항체를 가진 대표적인 IHC를 포함합니다. 우리의 목표는 안구 후방 컵 해부에서 IHC에 완전한 프로토콜을 제공하여 망막의 IHC 연구를 최적화하는 것입니다.

서문

면역 조직 화학 (IHC)는 1,2,^3의조직에서 특정 단백질 과 세포 구조를 국소화하기위한 강력한 기술입니다. 복잡한 조직의 부적절한 고정 방법 및 최적 절편은 조직 구조를 방해하거나, 높은 배경 염색을 생성하거나 항체 에피토프 상호 작용을 감소시켜 유물을 염색하고 결과적으로 잘못된 해석을 초래할 수 있습니다. IHC 데이터⁴. 척추동물 망막은 상호 연결된 광수용체, 인터뉴런 및 신경절 세포의 지층으로 구성된 복잡하고 고도로 조직된 신경 기관이기 때문에 매우 취약하며 해부 및 절편 중에 쉽게 중단 될 수 있습니다. 마우스 눈 해부 및 면역 염색에 이르는 상세하고 표준화되고 검증된 프로토콜은 IHC 아티팩트를 크게 감소시켜 결과의 신뢰성을 높이고 보다 정확한 비교 데이터를 가능하게 합니다. 분석.

IHC를 위한 조직 준비를 위한 많은 프로토콜이 있습니다, 그러나, 모두가 망막 조직을 위해 적당하지 않습니다. 10 % 포르말린 또는 Bouin의 용액과 같은 강력한 고정제는 해부 및 절편^동안망막 구조를 보존5 . 불행하게도, 강한 고정식은 종종 에피토프 6의 화학적 변형으로 인해 향상된 배경 형광및 에피토프 마스킹으로 이어질 . 다른 한편으로는, 온화한 고착제, 같은 4% 파라 포름 알데히드 (PFA) 이러한 유물의 일부를 완화 수 있지만 최적의 망막 구조를 보존하기 위해 세심한 해부 및 단면이 필요합니다. PFA는 조직을 빠르게 관통하지만 단백질을 매우 느리게 연결하여 에피토프 마스킹의 위험을 줄입니다. 짧은 시간 PFA 배양은 상대적으로 온화한 고정이기 때문에, 조직은 수시로 항원을 보존하기 위하여 급속한 동결을 요구합니다. 그들은 왜곡세포와 조직의 무결성을 손상으로 조직 동결 동안 얼음 결정형성을 방지하는 것이 중요하다 7.

여기서는 일관되고 신뢰할 수 있는 IHC 데이터를 산출하는 마우스 안구 후방 컵의 해부, 고정 및 냉동 보호를 위한 상세하고 표준화된 프로토콜을 설명합니다.

프로토콜

여기에 설명된 모든 방법은 실험실 동물 자원 연구소에서 제공하는 실험실 동물의 관리 및 사용을 위한 국립 보건 원의 권고사항에 따라 엄격하게 수행되었으며, 펜실베니아 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회.

메서드에 대한 모든 도구와 장비는 그림 1에 나와 있으며 재료표에 나열되어 있습니다.

1 . 마우스 눈 핵, 눈 컵 해부 및 포함

1. 이산화탄소 (CO2)를 가진안락사 마우스는 참수 (산후 마우스 P0 - P11) 또는 자궁 경부 탈구 (성인 >P11 마우스)에 의해 뒤따릅니다. P0-P14 마우스의 경우, 눈은 피부로 덮여 있습니다. 후속 단계 전에 피부를 제거하십시오.
2. 꼬리 소작기를 사용하여 각막을 약간 연소시켜 눈의 측두체 부분을 표시합니다(그림2A). 각막을 매우 가볍게 만져서 각막에 구멍을 뚫지 말고 소작으로 1 초 이상 두지 마십시오.
3. 구부러진 Dumont #5/45 포셉을 사용하여 마우스 눈을 즉시 enucleate합니다. 1.5 mL 저온 튜브에서 1mL의 파라포름알데히드(PFA)를 얼음 위에 인산완충 식염수(PBS)로 15분 동안 배양합니다.
4. 4% PFA에서 15분 후, 곡선 포셉 듀몬트 #5/45를 사용하여 고정된 눈을 수정된 35mm 해부 접시(재료 표 및 그림 1C참조)로 옮기고 해부 현미경 으로 배치합니다.
5. 마이크로 나이프를 사용하여 팔다리 (각막의 테두리)에 수직으로 화상 자국에서 작은 절개를하십시오.
6. 절개에 곡선 가위를 삽입하고 팔다리 다음 각막의 원주 절단을 수행 (그림2B).
7. 각막을 제거하고 얇은 Dumont #5 집게로 렌즈를 추출하고 (그림2B)눈의 뒤쪽 부분에서 섬세하게 들어 올립니다. 렌즈와 망막 사이의 공간을 채우는 유리체, 클리어 젤은 렌즈 (그림2B)와함께 나올 것이며 망막은 후방 눈 컵의 내부를 덮는 흰색 표면으로 볼 수 있습니다. 구멍이나 눈물과 같은 망막에 눈에 띄는 손상이없는지 확인합니다(그림 2C).
8. 실온에서 10분 동안 PBS 1mL에 아이컵을 두 번 씻습니다.
9. 아이컵이 가라앉을 때까지 PBS에서 밤새 15% 자당용으로 평형화하여 아이컵을 냉동 보호
10. 아이컵이 가라앉을 때까지 2-3시간 동안 PBS에서 30% 자당으로 아이컵을 옮김시.
11. 10 x 10mm 크라이오몰드 (그림3A)에10 x 10mm의 눈 컵을 포함시다. 해부 현미경을 사용하여, 등쪽-복부 축을 따라 극저온에서 눈을 배향(그림 2D, 그림 3A)화상 마크가 상단에 될 때까지 눈을 회전시켜, 시신경은 왼쪽에 있고 금형의 절단 부분은 오른쪽을 향하고 ( 그림2D)를 참조하십시오. 조직 근처의 거품을 피하기 위해주의하십시오.
    참고: 아이컵을 조작하려면 파이펫 팁에 부착된 티타늄 와이어로 만든 티타늄 프로브를 사용하십시오.
12. 망막 조직을 스냅 동결하려면, isopentane을 포함하는 금속 비커에 적어도 5 분 동안 cryomold를 담그고 액체 질소 또는 드라이 아이스 / 100 % 에탄올 목욕 (금속 비커 높이의 최대 1/3)에 비커를 놓습니다.
    참고 : 크라이오몰드는 이소마에 잠겨있어야합니다그것의 높이의 절반 이상으로 opentane하지만 완전히 침수 할 필요가 없습니다.
13. 냉동 블록을 제거하고 알루미늄 호일에 포장합니다.
14. -80 °C에서 보관하십시오.
15. 펜이나 샤키를 사용하여 고정된 블록을 표시하여 블록의 방향을 기록합니다(그림3B).

2 . 저온 극저온을 이용한 절제

1. 저온 온도(--20~-25°C 사이)를 조정한 후, 내장된 아이컵이 포함된 몰드가 1시간 동안 저온 온도에 평형을 되도록 합니다.
2. 도르소 복부 방향(그림3C)으로블록을 설치하고 10 μm 두께의 직렬 섹션을 잘라냅니다. 주석이 달고 번호가 매겨진 현미경 슬라이드에 망막 절편을 조심스럽게 놓습니다.
3. 슬라이드를 IHC 절차가 될 때까지 -20°C 또는 -80°C의 슬라이드 상자에 보관하십시오.

3 . 슬라이드 랙을 이용한 형광 면역 염색

참고: 슬라이드 랙 시스템(예: Sequenza)은 커버 플레이트가 있는 유리 현미경 슬라이드를 수납하여 슬라이드와 플레이트 사이에 ~100 μL 모세관 간격을 만듭니다.

1. 저온 섹션을 실온(RT)에서 2시간 에서 4시간 동안 해동하여 건조시키고 현미경 슬라이드에 부착할 수 있도록 합니다.
   참고 : 30-37 °C에서 30 분 내지 1 시간 동안 건조할 수도 있습니다.
2. 슬라이드 랙에 슬라이드를 놓고 망막 부분을 100-200 μL PBS에서 2 분 동안 두 번 씻습니다.
3. RT에서 5분 동안 PBS에서 0.25% 트리톤-X/0.05% NaN 3로배양하여 망막 절편을 투과한다.
4. 슬라이드에 차단 용액 100 μL을 추가합니다.
5. 슬라이드에 차단 용액에서 희석 된 1 차 항체 100 μL을 추가하십시오.
6. 4°C에서 하룻밤 동안 망막 절편을 배양한다.
   참고: 이 시간 동안 슬라이드 랙을 덮어 섹션의 탈수방지를 피하십시오.
7. 망막 부분을 3회, 각각 15분 동안 200 μL PBS를 사용하여 세척합니다.
   참고 : 0.001- 0.002 % 트리톤-X100을 PBS (PBS-T)에 추가하면 보다 엄격한 세척이 허용되지만 일부 멤브레인 및 세포 구조를 방해 할 수 있습니다.
8. RT에서 1 시간 동안 형광 표지 된 이차 항체에서 망막 절편을 배양하십시오. 지금부터 빛으로부터 보호합니다.
9. 망막 부분을 3 회, 각각 15 분 동안 씻으소서.
10. Hoechst 33342 또는 DAPI 용액과 같은 핵 마커로 RT에서 망막 절편을 5분 동안 배양합니다.
11. 망막 부분을 15 분 동안 1 회 씻으하십시오.
12. 실험실 벤치에 종이 타월 위에 덮개를 놓습니다.
13. 커버슬립 중앙에 페이딩 방지 마운팅 미디어 2방울을 추가합니다.
14. 슬라이드를 뒤집어 망막 저온 섹션이 아래를 향하도록 합니다.
15. 커버슬립을 ~45° 각도로 천천히 천천히 장착하고 슬라이드를 장착 용지에 끼우십시오.
    참고: 슬라이드를 제자리에 낮출 때 거품형성을 피하십시오.
16. 무거운 책이나 카탈로그(아래 참조)를 슬라이드 커버슬립 조합에 사용하여 압력을 균등하게 가하여 과도한 장착 매체를 제거합니다.
    참고: 샘플 준비의 일관성을 보장하려면 항상 동일한 객체(즉, 동일한 책 또는 카탈로그)를 사용하여 슬라이드 장착 중에 커버슬립에 균등한 압력을 가하십시오.
17. 평평하게 유지하고 어둠 속에서 RT에서 하룻밤 동안 굳어지도록 하십시오. 슬라이드를 4°C에서 무기한으로 평평하게 보관하십시오.
18. 광시야 또는 공초점 형광 현미경 검사법을통한 이미지(그림 4).

결과

이러한 프로토콜이 IHC에 대한 최적의 망막 보존을 보장하는 방법을 설명하기 위해, 우리는 P28 WT 마우스 (C57BL / 6N)에서 로도프신(광수용체 마커)에 대한 항체로 망막 절편을 8, 글루탐산 데카르복실라제 65 (Gad65, amacrine 세포)를 조사했습니다. 마커)9, 글루타민 합성체 (GS, 뮐러 세포 마커)^10,및 칼빈딘 (수평 세포 마커)

토론

마우스 망막 절제술은 마우스 눈의 작은 크기와 모양과 망막 조직의 취약성으로 인해 섬세한 과정입니다. 고품질 해부를 수행하는 것은 연습의 문제이지만, 상세한 프로토콜을 갖는, 효율적인 방법과 팁을 제공하는 것은 망막 절편과 IHC를 얻기 위해 필수적이다. 여기에 설명된 프로토콜 외에도 재현 가능한 IHC에 적합한 일관된 고품질 망막 섹션을 허용하는 몇 가지 팁이 있습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
6qt. Stainless Steel Beaker (185 x 218mm)	Gilson	#MA-48	For liquid nitrogen (Figure 1E)
Aluminum foil
Cauterizer	Bovie	#AA01	To mark eye orientation (Figure 1A)
Curved forceps, Dumont #5/45 tweezers, 45-degrees bent	Electron Microscopy Sciences	#72703-D	For mouse eye enucleation and maintenance (Figure 1A)
Curved scissors, Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge	Fine Science Tools	#15002-08	To circumferentially cut the cornea (Figure 1B)
Dental wax-coated 35mm dissection dish			For eye cup dissection (Figure 1C)
Dissecting microscope	Leica, Houston, USA	MZ12.5 High-performance stereomicroscope
Micro Knives - Plastic Handle	Fine Science Tools	#10315-12	To make a small incision at the burn mark (Figure 1A)
Pink dental wax	Electron Microscopy Sciences	#72660	For coating dissection dish
Slide Rack and Coverplate	Ted Pella	#36107	For retinal IHC (Figure 1G)
Stainless Steel Beaker (89 x 114mm)	Gilson	#MA-40	For isopentane bath (Figure 1E)
Styrofoam box			For insulated cooler
Thin forceps Dumont #5	Fine Science Tools	#11254-20	To remove the cornea and extract the lens (Figure 1B)
Tissue-Tek cryomold  (10mm x 10mm x 5mm)	Electron Miscroscopy Sciences	#62534-10	Mold for OCT embedding
Buffers and Reagents	Company	Catalog Number	Comments
Blocking solution			2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in permeabilization buffer.
Gelvatol (anti-fading mounting media)			Under the fume hood, dissolve 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01).  Adjust to pH 8-8.5 with 12N HCl (~ 5 drops).  Store in amber drop bottle at 4°C  (8).
Hoechst 33342 1000x Stock	Thermo Scientific	#62249	1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquot and store in dark, at 4°C for up to 1 year or at -20°C for long term storage. Prepare fresh  at 1 ug/mL (1x)
Isopentane, 99%	GFS Chemicals	#2961
Liquid Nitrogen
Paraformaldehyde (PFA) in PBS	Electron Microscopy Sciences	#15710	Prepared fresh 4% PFA from 16% PFA stock. Store the remaining 16% PFA at 4°C in the dark.
Permeabilization solution			PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3.  Prepare fresh.
Phosphate-buffered saline (PBS)	Bioworld	#41620015-20	0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4.  Prepared from 10x stock
Sucrose solutions	Fisher Scientific	#S-5-500	Dissolve the appropriate amount of sucrose in  37°C PBS (takes ~15 min to dissolve). May be stored for a few days at 4°C.
Tissue-Tek OCT-compound	Sakura	#4583
Antibodies	Company	Catalog Number	Comments
anti-calbindin	Sigma-Aldrich	C8666	To label horinzotal cells
anti-GAD65	Chemicon	AB5082	To label GABAergic amacrine cells
anti-GS	BD Transduction	610517	To label Müller cells
anti-rhodopsin	Millipore	MAB5316	To label rods