Immünhistokimya için fare retinal Cryo-bölümler hazırlanması

Özet

Bu raporda, immünhistokimya (ıHC) için dondurulmuş fare Retina bölümlerini hazırlamak için kapsamlı yöntemler açıklanmaktadır. Tanımlanan yöntemlerle oküler posterior bardak diseksiyonu, paraformaldehit fikstasyon, optimum kesme sıcaklığı (OCT) medya ve doku oryantasyonu, seksiyonlama ve immünostasyonu katıştırma bulunmaktadır.

Özet

İmmünhistokimya (ıHC) için yüksek kaliteli fare göz bölümlerinin hazırlanması, Retina yapısının ve fonksiyonunun değerlendirilmesi ve Retina hastalıklarının temelindeki mekanizmaların belirlenmesi için önemlidir. Doku hazırlığı boyunca yapısal bütünlüğünü sürdürmek, tekrarlanabilir Retina IFC verilerini elde etmek için hayati önem taşımaktadır, ancak Retina sitilinin kırılganlık ve karmaşıklığı nedeniyle zor olabilir. % 10 formalin veya Bouin çözeltisi gibi güçlü fiksatörler Retina yapıyı optimum şekilde korur, genellikle arka plan floresan ve/veya azalan antikor-epitopu etkileşimleri, epitopu maskeleme olarak bilinen bir süreci artırarak IFC analizini azaltır. Diğer taraftan,% 4 paraformaldehit gibi daha hafif fiksatörler, retina yapısını korumak için arka plan floresan ve epitope-maskeleme, titiz diseksiyon tekniklerini azaltmıştır. Bu yazıda, Retina yapısal bütünlük kaybı olmadan en antikor-epitope etkileşimlerini korumak için yeterli olan IFC için fare oküler posterior bardakları hazırlamak için kapsamlı bir yöntem sunuyoruz. En uygun ve en uygun koşullarda doku koruma ve oryantasyonunu göstermek için çeşitli Retina hücre tipi belirteçleri için antikor ile temsilci ıHC içerir. Amacımız ihc 'de oküler posterior fincan diseksiyon tam bir protokol sağlayarak retinada ıFC çalışmalarını optimize etmektir.

Giriş

İmmünhistokimya (IHC), situ^1,2,3' te dokularda spesifik proteinleri ve hücresel yapıları yerelleştirme için güçlü bir tekniktir. Uygunsuz fiksasyon yöntemleri ve kompleks dokuların alt-optimum kesmesi doku yapısını bozabilir, yüksek arka plan boyama veya antikor-epitope etkileşimlerini azaltır, boyama eserler ve sonuç olarak yanlış yorumlama sonucu IFC veri⁴. Vertebrat retinası, birbirine bağlı fotoreceptörler, internöronlar ve ganglion hücrelerinin tabaklarından oluşan kompleks ve son derece organize nöral organdır, çok kırılgan ve diseksiyon ve sekleme sırasında kolayca bozulabilir. Fare göz diseksiyonu ve immünostasyon oryantasyonlarından ayrıntılı, standartlaştırılmış ve onaylanmış bir protokol, ıHC yapılarını önemli ölçüde azaltmaya yardımcı olur, böylece sonuçların güvenilirliğini arttırır ve daha doğru karşılaştırmalı veri sağlar Analysis.

IHC için doku hazırlama için birçok protokol vardır, ancak, tüm Retina doku için uygun değildir. % 10 formalin veya Bouin çözeltisi gibi güçlü fiksatörler, diseksiyon ve sekleme sırasında retina yapısını korur⁵. Ne yazık ki, güçlü fiksasyonlar genellikle Gelişmiş arka plan floresans ve epitopu maskeleme nedeniyle epitoplar kimyasal modifikasyon⁶yol açar. Öte yandan,% 4 paraformaldehit (PFA) gibi daha hafif fiksatörler, bu yapıtlardan bazılarını hafifletebilir ancak optimum retina yapısını korumak için titiz diseksiyon ve sekürleme gerektirir. PFA hızla dokuya nüfuz eder, ancak proteinleri çok yavaş çapraz bağlar, epitopu maskeleme riskini azaltır. Kısa süre içinde PFA inkübasyon nispeten hafif bir fikfasyon olduğundan, dokularda genellikle antijenleri korumak için hızlı donma gerektirir. Doku donma sırasında buz kristali oluşumunun önlenmemesi ve hücrelerin ve dokularının bütünlüğünü bozması önemlidir⁷.

Burada, tutarlı ve güvenilir ıFC verilerini sağlayan fare oküler posterior bardakların diseksiyon, sabitleme ve Cryo koruması için ayrıntılı ve standartlaştırılmış protokoller açıklanmaktadır.

Protokol

Burada tarif edilen tüm yöntemler, laboratuar hayvan kaynakları Enstitüsü tarafından sağlanan Laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için Ulusal Sağlık Rehberi 'nin önerileri ile sıkı bir şekilde yürütülmüştür ve Pennsylvania Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi.

Yöntem için tüm araç ve ekipmanlar Şekil 1 ' de gösterilir ve malzeme tablosundalistelenir.

1. Fare göz enucleation, göz bardağı diseksiyon ve gömme

1. Karbon dioksit (Co₂) ile ötenize fareler (postnatal fareler P0-P11) veya servikal çıkığı (Yetişkin > P11 fareler) ya dekasitasyon izledi. P0-P14 fareler için, gözler deri ile kaplıdır. Sonraki adımlardan önce cildi kaldırmak için emin olun.
2. Gözün temporal kısmını işaretleyin (Şekil 2a) bir kuyruk cauterizer kullanarak biraz kornea yakmak. Kornea çok hafifçe dokunarak ve cauterizer ile bir bölünmüş ikinci daha fazla değil, kornea bir delik yakmak kaçının.
3. Hemen eğimli Dumont #5/45 forseps kullanarak fare gözleri anlatabilirsin. Buz üzerinde fosfat-tamponlu tuz (PBS) içinde 1 ml% 4 paraformaldehit (PFA) ile 1,5 ml geminizi tüpünde 15 dakika boyunca inküye yapın.
4. % 4 PFA 15 dakika sonra, sabit göz kavisli forseps kullanarak transfer Dumont #5/45 değiştirilmiş bir 35 mm diseksiyon çanak için (bkz: malzeme ve Şekil 1C tablo ) PBS ile dolu ve diseksiyon mikroskop altında yer.
5. Mikro bıçağı kullanarak limbus (kornea sınırı) üzerinde ve sadece üzerinde dik, yanık işareti küçük bir kesi olun.
6. Eğri makas kesi içine yerleştirin ve limbus aşağıdaki kornea bir çevresel kesim gerçekleştirmek (Şekil 2B).
7. Kornea çıkarın ve ince bir Dumont #5 forseps ile objektif ayıklamak, (Şekil 2B) ve özenle uzak gözün posterior kısmından kaldırın. Vitreus Vücut, objektif ve Retina arasındaki boşluğu dolduran açık jel, objektif (Şekil 2B) ile ortaya çıkar ve Retina arka göz bardağı iç kapsayan beyaz bir yüzey olarak görünür olacaktır. Retinada delik veya gözyaşı gibi görünür bir hasar olmadığından emin olun (Şekil 2C).
8. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1 mL PBS 'de iki kez göz bardağı yıkayın.
9. Göz bardağı lavabolar kadar 4 °c gecede PBS% 15 sakaroz bir çözüm onları dengeleyici tarafından göz bardağı koruyun
10. Göz bardağı lavabolar kadar 2-3 h için PBS içinde% 30 sakaroz su bardağı aktarın.
11. 10 x 10 mm cryomolds (Şekil 3A) Ekim ayında göz bardağı katıştırın. Bir diseksiyon mikroskop kullanarak, onun dorsal-ventral ekseni boyunca cryomold göz yönlendirmek (Şekil 2D, Şekil 3A) yanık işareti üstte kadar göz çevirerek, optik sinir solda ve kalıp kesme parçası sağ yüzleri ( Şekil 2D). Doku yakınındaki kabarcıkları önlemek için dikkat alın.
    Not: göz bardağı manipüle etmek Için, bir pipet ucu bağlı bir titanyum tel yapılmış bir titanyum prob kullanın.
12. Retina dokusu Snap-dondurmak için, ısopentane içeren bir metal kabı en az 5 dk için cryomold daldırın ve sıvı nitrojen veya kuru buz/% 100 etanol banyosu içinde kabı yerleştirin (kadar 1/3 metal kabı yüksekliği).
    Not: cryomold ısopentane içinde yüksekliğinin yarısından daha büyük, ancak tamamen subbirleştirilmiş olması gerekmez dalmış olmalıdır.
13. Dondurulmuş bloğu çıkarın ve alüminyum folyo içinde sarın.
14. -80 °C ' de saklayın.
15. Blokun yönünü kaydetmek için bir kalem veya keskinleştirme kullanarak dondurulmuş bloğu işaretleyin (Şekil 3B).

2. Bir kriyostat kullanarak bölümleme

1. Kriyostat sıcaklığını (-20 ve-25 °C arasında) ayarladıktan sonra, gömülü göz bardakları içeren kalıpların 1 h için kriyostat sıcaklığına dengelenmesine izin verin.
2. Bloğu Dorso-ventral oryantasyona (Şekil 3c) takın ve 10 μm kalınlığında seri bölümleri keser. Retina bölümlerini dikkatle detaylandırılmış ve numaralandırılmış mikroskop slaytlarına yerleştirin.
3. Slayt kutularındaki slaytlar-20 °C veya-80 °C ' ye kadar ıFC prosedürlerine kadar saklayın.

3. Slayt raf kullanarak floresan immünostans

Not: slayt raf sistemi (örn., Sequenza), cam mikroskop slaytlarını bir kapak plakasına sahiptir ve slayt ile plaka arasında bir ~ 100 μL kapiller boşluğu yaratmaktadır.

1. Oda sıcaklığında (RT) Cryo-bölümlerin, Kuru ve mikroskop slaytlarına bağlaymalarına izin vermek için 2 saat ile 4 saat arasında çözüyor.
   Not: Ayrıca 30-37 °C ' de 30 dakika ila 1 saat boyunca kurutmak mümkündür.
2. Slaytları Slayt rafa yerleştirin ve 100-200 μL PBS 'de 2 dakika boyunca retina bölümleri iki kez yıkayın.
3. RT 'de 5 dakika boyunca PBS 'de% 0,25 Triton-X/0,05% Nan₃' te onları inküle ederek Retina bölümleri geçirgen.
4. 100 Ekle μL slaytlar için çözüm engelleme.
5. 100 ekleme μL birincil antikor slaytlar için engelleme çözümü seyreltilmiş.
6. Retina bölümlerini 4 °C ' de geceleyin.
   Not: Bu süre zarfında, bölümlerin kurutmaması için slayt rafa 'nı kapun.
7. Retina bölümleri 3 kez, her biri 15 dakika boyunca, 200 μL PBS kullanarak yıkayın.
   Not: 0,001-0,002% Triton-X100 PBS (PBS-T) ilavesi daha sıkı bir yıkama sağlar ama bazı membranlar ve hücresel yapıları bozabilir.
8. RT 'de 1 h için floresan etiketli ikincil antikorlarda Retina bölümleri inkük. Şu andan itibaren ışığın korunması.
9. Retina bölümlerini 3 kez, her biri 15 dakika yıkayın.
10. Hoechst 33342 veya DAPI solüsyonu gibi bir nükleer Marker ile RT 'de Retina bölümleri 5 dakika boyunca kulvarın.
11. Retina bölümleri 15 dakika boyunca 1 kez yıkayın.
12. Laboratuvar tezgah üzerinde bir kağıt havlu üstüne bir lamel magazini yerleştirin.
13. Coverslip merkezine Anti-solma montaj medya 2 damla ekleyin.
14. Retina Cryo bölümünün aşağı bakacak şekilde slaytı çevirin.
15. Lamel magazini 'ı ~ 45 ° ' lik bir açı ile dikkatlice monte edin ve slayt üzerine montaj ortamına doğru kaydırın.
    Not: slaytı yerine düşürmeye çalıştığınızda baloncuklar oluşturarak kaçınarak.
16. Aşırı montaj ortamını ortadan kaldırmak için ağır bir kitap veya katalog kullanarak (aşağıya bakın), slayt-coverslip kombinasyonuna bile basınç uygulayın.
    Not: örnek hazırlıkta tutarlılığı sağlamak Için, her zaman aynı nesneyi kullanın (örn. aynı kitap veya katalog), slayt montajı sırasında kapak kaymasına bile baskı uygulamak için.
17. Düz tutun ve karanlıkta RT bir gecede sertleşmesine izin. Slaytlar 4 °C ' de sonsuza kadar düz saklayın.
18. Geniş alan veya konfokorik floresan mikroskobu ile görüntü (Şekil 4).

Sonuçlar

Nasıl bu protokoller, IFC için optimum Retina koruma sağlamak göstermek için, biz P28 WT fareler (C57BL/6N) rodopsin (bir fotoreceptor Marker) antikorlar ile retina bölümler probed⁸, glutamik asit decarboksilaz 65 (Gad65, bir amacrine hücre Marker)⁹, glutamin sentetaz (GS, bir Müller hücre Marker)¹⁰, ve calbindin (yatay hücre işaretleyicisi)¹¹ (Şekil 4...

Tartışmalar

Fare Retina diseksiyon küçük boyutu ve fare gözleri şekli ve Retina doku kırılganlık nedeniyle hassas bir süreçtir. Yüksek kaliteli diseksiyon yapmak bir uygulama meselesi olsa da, ayrıntılı bir protokole sahip olmak, verimli yöntemler ve ipuçları sağlamak Retina bölümler ve IHC elde etmek için bir zorunluluktur. Burada açıklanan protokollere ek olarak, tekrarlanabilir IHC için uygun olan tutarlı yüksek kaliteli Retina bölümler için izin çeşitli ipuçları vardır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
6qt. Stainless Steel Beaker (185 x 218mm)	Gilson	#MA-48	For liquid nitrogen (Figure 1E)
Aluminum foil
Cauterizer	Bovie	#AA01	To mark eye orientation (Figure 1A)
Curved forceps, Dumont #5/45 tweezers, 45-degrees bent	Electron Microscopy Sciences	#72703-D	For mouse eye enucleation and maintenance (Figure 1A)
Curved scissors, Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge	Fine Science Tools	#15002-08	To circumferentially cut the cornea (Figure 1B)
Dental wax-coated 35mm dissection dish			For eye cup dissection (Figure 1C)
Dissecting microscope	Leica, Houston, USA	MZ12.5 High-performance stereomicroscope
Micro Knives - Plastic Handle	Fine Science Tools	#10315-12	To make a small incision at the burn mark (Figure 1A)
Pink dental wax	Electron Microscopy Sciences	#72660	For coating dissection dish
Slide Rack and Coverplate	Ted Pella	#36107	For retinal IHC (Figure 1G)
Stainless Steel Beaker (89 x 114mm)	Gilson	#MA-40	For isopentane bath (Figure 1E)
Styrofoam box			For insulated cooler
Thin forceps Dumont #5	Fine Science Tools	#11254-20	To remove the cornea and extract the lens (Figure 1B)
Tissue-Tek cryomold  (10mm x 10mm x 5mm)	Electron Miscroscopy Sciences	#62534-10	Mold for OCT embedding
Buffers and Reagents	Company	Catalog Number	Comments
Blocking solution			2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in permeabilization buffer.
Gelvatol (anti-fading mounting media)			Under the fume hood, dissolve 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01).  Adjust to pH 8-8.5 with 12N HCl (~ 5 drops).  Store in amber drop bottle at 4°C  (8).
Hoechst 33342 1000x Stock	Thermo Scientific	#62249	1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquot and store in dark, at 4°C for up to 1 year or at -20°C for long term storage. Prepare fresh  at 1 ug/mL (1x)
Isopentane, 99%	GFS Chemicals	#2961
Liquid Nitrogen
Paraformaldehyde (PFA) in PBS	Electron Microscopy Sciences	#15710	Prepared fresh 4% PFA from 16% PFA stock. Store the remaining 16% PFA at 4°C in the dark.
Permeabilization solution			PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3.  Prepare fresh.
Phosphate-buffered saline (PBS)	Bioworld	#41620015-20	0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4.  Prepared from 10x stock
Sucrose solutions	Fisher Scientific	#S-5-500	Dissolve the appropriate amount of sucrose in  37°C PBS (takes ~15 min to dissolve). May be stored for a few days at 4°C.
Tissue-Tek OCT-compound	Sakura	#4583
Antibodies	Company	Catalog Number	Comments
anti-calbindin	Sigma-Aldrich	C8666	To label horinzotal cells
anti-GAD65	Chemicon	AB5082	To label GABAergic amacrine cells
anti-GS	BD Transduction	610517	To label Müller cells
anti-rhodopsin	Millipore	MAB5316	To label rods