Preparación de criosecciones retinianas de ratón para inmunohistoquímica

Resumen

Este informe describe métodos completos para preparar secciones de retina de ratón congeladas para inmunohistoquímica (IHC). Los métodos descritos incluyen disección de la copa ocular posterior, fijación de paraformaldehído, incrustación en la temperatura de corte óptima (OCT) orientación de medios y tejidos, seccionamiento e inmunomancha.

Resumen

La preparación de secciones oculares de ratón de alta calidad para la inmunohistoquímica (IHC) es fundamental para evaluar la estructura y la función de la retina y para determinar los mecanismos subyacentes a las enfermedades de la retina. Mantener la integridad estructural en toda la preparación del tejido es vital para obtener datos reproducibles de IHC de la retina, pero puede ser difícil debido a la fragilidad y complejidad de la citoarquitectura de la retina. Los fijadores fuertes como el 10% de la formalina o la solución de Bouin preservan de manera óptima la estructura de la retina, a menudo impiden el análisis de IHC al mejorar la fluorescencia de fondo y/o disminuir las interacciones entre anticuerpos y epítopos, un proceso conocido como enmascaramiento de epítopos. Los fijadores más leves, por otro lado, como el 4% de paraformaldehído, reducen la fluorescencia de fondo y el enmascaramiento de epítopos, se deben utilizar técnicas de disección meticulosas para preservar la estructura de la retina. En este artículo, presentamos un método integral para preparar vasos posteriores oculares de ratón para IHC que es suficiente para preservar la mayoría de las interacciones entre anticuerpos y epítopos sin pérdida de integridad estructural de la retina. Incluimos IHC representativo con anticuerpos a varios marcadores de tipo célula de la retina para ilustrar la preservación y orientación del tejido en condiciones óptimas y subóptimas. Nuestro objetivo es optimizar los estudios IHC de la retina proporcionando un protocolo completo de la disección ocular posterior de la copa a IHC.

Introducción

La inmunohistoquímica (IHC) es una poderosa técnica para localizar proteínasespecíficas y estructuras celulares en tejidos in situ 1,^2,3. Los métodos de fijación inapropiados y la sección subóptima de tejidos complejos pueden alterar la estructura tisular, generar manchas de fondo alto o disminuir las interacciones entre anticuerpos y epítopos, lo que resulta en artefactos de tinción y la consiguiente interpretación errónea de Datos IHC⁴. Como la retina vertebrada es un órgano neural complejo y altamente organizado compuesto por estratos de fotorreceptores interconectados, interneuronas y células ganglionares, es muy frágil y puede ser fácilmente interrumpida durante la disección y seccionamiento. Un protocolo detallado, estandarizado y validado desde la disección de ojos del ratón y la orientación hasta la inmunomancha ayudará a reducir significativamente los artefactos IHC, aumentando así la fiabilidad de los resultados y permitiendo datos comparativos más precisos Análisis.

Hay muchos protocolos para la preparación de tejidos para IHC, sin embargo, no todos son adecuados para el tejido de la retina. Fijadores fuertes como 10% de formalina o solución de Bouin preservan la estructura de la retina durante la disección y seccionamiento⁵. Desafortunadamente, los fijadores fuertes a menudo conducen a la fluorescencia de fondo mejoraday el enmascaramiento de epítopos debido a la modificación química de los epítopos 6. Por otro lado, fijadores más suaves, como 4% paraformaldehído (PFA) pueden aliviar algunos de estos artefactos, pero requieren disección meticulosa y seccionamiento para preservar la estructura óptima de la retina. La PFA penetra rápidamente en el tejido, pero relatifica las proteínas muy lentamente, reduciendo el riesgo de enmascaramiento de epítopos. Dado que la incubación de PFA de poco tiempo es una fijación relativamente leve, los tejidos a menudo requieren una congelación rápida para preservar los antígenos. Es importante evitar la formación de cristales de hielo durante la congelación de tejidos, ya que distorsionan y dañan la integridad de las células y tejidos⁷.

Aquí describimos protocolos detallados y estandarizados para la disección, fijación y crioprotección de copas posteriores oculares de ratón que producen datos De IHC consistentes y confiables.

Protocolo

Todos los métodos descritos aquí se llevaron a cabo de acuerdo con las recomendaciones de la Guía de Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio proporcionada por el Instituto de Recursos Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Pensilvania.

Todas las herramientas y equipos para los métodos se muestran en la Figura 1 y se enumeran en la Tabla de materiales.

1 . Enucleación del ojo del ratón, disección de la copa del ojo, y la incrustación

1. Ratones eutanasiados con dióxido de carbono (CO₂) seguidos de decapitación (ratones postnatales P0 - P11) o luxación cervical (adultos > ratones P11). Para ratones P0-P14, los ojos están cubiertos por la piel. Asegúrese de retirar la piel antes de los pasos posteriores.
2. Marque la parte temporal del ojo (Figura2A)quemando ligeramente la córnea usando un cauterizador de cola. Evite quemar un agujero en la córnea tocando la córnea muy ligeramente y durante no más de una fracción de segundo con el cauterizador.
3. Inmediatamente enuclea los ojos del ratón usando #5 Dumont curvado/45 fórceps. Incubar durante 15 minutos en un tubo criotubo de 1,5 ml con 1 ml de paraformaldehído (PFA) al 4% de paraformaldehído (PFA) en solución salina con fosfato (PBS) sobre hielo.
4. Después de 15 minutos en 4% pfa, transfiera el ojo fijo utilizando los fórceps curvos Dumont #5/45 a una placa de disección modificada de 35 mm (ver Tabla de Materiales y Figura 1C)llena de PBS y colóquela bajo el microscopio de disección.
5. Hacer una pequeña incisión en la marca de quemadura, perpendicular y justo por encima del limbo (borde de la córnea) usando el micro cuchillo.
6. Inserte las tijeras curvas en la incisión y realice un corte circunferencial de la córnea después del limbo (Figura 2B).
7. Retire la córnea y extraiga la lente con un Dumont delgado #5 fórceps, (Figura2B)y levántela delicadamente de la parte posterior del ojo. El cuerpo vítreo, el gel transparente que llena el espacio entre la lente y la retina, saldrá con la lente (Figura2B)y la retina será visible como una superficie blanca que cubre el interior de la copa ocular posterior. Asegúrese de que no haya ningún daño visible a la retina, como agujeros o desgarros (Figura2C).
8. Lave los vasos oculares dos veces en 1 ml de PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente.
9. Cryoprotect los vasos oculares equilibrando en una solución de 15% de sacarosa en PBS durante la noche a 4oC hasta que el ocular se hunda
10. Transfiera los vasos oculares a una sacarosa del 30% en PBS durante 2-3 h hasta que la copa del ojo se hunda.
11. Incruste los oculares en OCT en criomoldes de 10 x 10 mm (Figura3A). Usando un microscopio de disección, oriente el ojo en el criomold a lo largo de su eje dorsal-ventral (Figura2D, Figura 3A) girando el ojo hasta que la marca de quemadura esté en la parte superior, el nervio óptico esté a la izquierda y la parte recortada del molde se dirija hacia la derecha ( Figura 2D). Tenga cuidado de evitar burbujas cerca del tejido.
    NOTA: Para manipular la copa del ojo, utilice una sonda de titanio hecha de un alambre de titanio unido a una punta de pipeta.
12. Para congelar a presión el tejido de la retina, sumerja el criomold durante al menos 5 minutos en un vaso de precipitados metálicos que contenga isopentano y coloque el vaso de precipitados en nitrógeno líquido o en el baño de etanol seco/100% (hasta 1/3 de la altura del vaso de precipitados metálicos).
    NOTA: El criomold debe sumergirse en isopentano a más de la mitad de su altura, pero no tiene que estar completamente sumergido.
13. Retire el bloque congelado y envuélvalo en papel de aluminio.
14. Conservar a -80oC.
15. Marque el bloque congelado con un lápiz o un punzón para registrar la orientación del bloque (Figura3B).

2 . Seccionamiento con un criostato

1. Después de ajustar la temperatura del criostato (entre -20 y -25 oC), permita que los moldes que contienen los vasos oculares incrustados se equilibren a la temperatura del criostato durante 1 h.
2. Instale el bloque con orientación dorso-ventral (Figura3C)y corte secciones seriales de 10 m de espesor. Coloque cuidadosamente las secciones de la retina en diapositivas de microscopio anotadas y numeradas.
3. Almacene las diapositivas en cajas deslizantes a -20 oC o -80 oC hasta los procedimientos de IHC.

3 . Inmunomanchado de fluorescencia con el rack deslizante

NOTA: El sistema Slide Rack (p. ej., Sequenza) sostiene las guías del microscopio de vidrio con una placa de cubierta, creando un espacio capilar de 100 l entre la corredera y la placa.

1. Descongelar las criosecciones a temperatura ambiente (RT) durante 2 h a 4 h para permitir que se sequen y se adhieran a los portaobjetos del microscopio.
   NOTA: También es posible secarlos a 30-37 oC durante 30 min a 1 h.
2. Coloque los portaobjetos en el portaobjetos y lave las secciones de la retina dos veces en 100-200 l de PBS durante 2 min.
3. Permeabilizar las secciones de la retina incubando en 0.25% Tritón-X / 0.05% NaN₃en PBS durante 5 min a RT.
4. Añadir 100 sl de solución de bloqueo a las diapositivas.
5. Añadir 100 s de anticuerpo primario diluido en la solución de bloqueo a las diapositivas.
6. Incubar secciones de retina durante la noche a 4 oC.
   NOTA: Durante este tiempo, cubra el portaobjetos para evitar la desecación de las secciones.
7. Lavar las secciones de la retina 3 veces, cada una durante 15 minutos, utilizando 200 s de PBS.
   NOTA: La adición de 0.001- 0.002% Triton-X100 a PBS (PBS-T) permite un lavado más estricto, pero puede interrumpir algunas membranas y estructuras celulares.
8. Incubar secciones de retina en anticuerpos secundarios con etiqueta fluorescente durante 1 h a RT. A partir de ahora, protéjase de la luz.
9. Lave las secciones de la retina 3 veces, cada una durante 15 minutos.
10. Incubar las secciones de retina a RT durante 5 minutos con un marcador nuclear como Hoechst 33342 o solución DAPI.
11. Lave las secciones de la retina 1 vez durante 15 min.
12. Coloque una cubierta encima de una toalla de papel en el banco de laboratorio.
13. Agregue 2 gotas de soporte de montaje antidecoloración al centro de la cubierta.
14. Gire la diapositiva para tener la criosección de la retina hacia abajo.
15. Monte con cuidado el cubreobjetos lentamente, en un ángulo de 45o, incline la corredera sobre el soporte de montaje.
    NOTA: Evitar la formación de burbujas a medida que baja la diapositiva en su lugar.
16. Aplique una presión uniforme, utilizando un libro o catálogo pesado (ver más abajo), a la combinación de deslizamiento deslizante para eliminar el exceso de medios de montaje.
    NOTA: Para garantizar la coherencia en la preparación de la muestra, utilice siempre el mismo objeto (es decir, el mismo libro o catálogo) para aplicar una presión uniforme al cubreobjetos durante el montaje de la diapositiva.
17. Manténgase plano y deje que se endurezca durante la noche en RT en la oscuridad. Almacene los portaobjetos planos a 4oC indefinidamente.
18. Imagen mediante campo ancho o microscopía de fluorescencia confocal (Figura4).

Resultados

Para ilustrar cómo estos protocolos, aseguran una preservación óptima de la retina para IHC, sondeamos secciones de retina de ratones P28 WT (C57BL/6N) con anticuerpos contra la rodopesina (un marcador de fotorreceptor)⁸, ácido glutámico descarboxilasa 65 (Gad65, una célula de amacrina 9, glutamina sintetasa (GS, un marcador de célula de M'ller)¹⁰, y calbindina (un marcador de celda horizontal)

Discusión

La disección de la retina del ratón es un proceso delicado debido al pequeño tamaño y forma de los ojos del ratón y la fragilidad del tejido de la retina. A pesar de que realizar disección de alta calidad es una cuestión de práctica, tener un protocolo detallado, proporcionar métodos y consejos eficientes es una necesidad para obtener secciones de retina e IHC. Además de los protocolos descritos aquí, hay varios consejos que permiten secciones de retina consistentes de alta calidad que son adecuadas para IHC r...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
6qt. Stainless Steel Beaker (185 x 218mm)	Gilson	#MA-48	For liquid nitrogen (Figure 1E)
Aluminum foil
Cauterizer	Bovie	#AA01	To mark eye orientation (Figure 1A)
Curved forceps, Dumont #5/45 tweezers, 45-degrees bent	Electron Microscopy Sciences	#72703-D	For mouse eye enucleation and maintenance (Figure 1A)
Curved scissors, Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge	Fine Science Tools	#15002-08	To circumferentially cut the cornea (Figure 1B)
Dental wax-coated 35mm dissection dish			For eye cup dissection (Figure 1C)
Dissecting microscope	Leica, Houston, USA	MZ12.5 High-performance stereomicroscope
Micro Knives - Plastic Handle	Fine Science Tools	#10315-12	To make a small incision at the burn mark (Figure 1A)
Pink dental wax	Electron Microscopy Sciences	#72660	For coating dissection dish
Slide Rack and Coverplate	Ted Pella	#36107	For retinal IHC (Figure 1G)
Stainless Steel Beaker (89 x 114mm)	Gilson	#MA-40	For isopentane bath (Figure 1E)
Styrofoam box			For insulated cooler
Thin forceps Dumont #5	Fine Science Tools	#11254-20	To remove the cornea and extract the lens (Figure 1B)
Tissue-Tek cryomold  (10mm x 10mm x 5mm)	Electron Miscroscopy Sciences	#62534-10	Mold for OCT embedding
Buffers and Reagents	Company	Catalog Number	Comments
Blocking solution			2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in permeabilization buffer.
Gelvatol (anti-fading mounting media)			Under the fume hood, dissolve 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01).  Adjust to pH 8-8.5 with 12N HCl (~ 5 drops).  Store in amber drop bottle at 4°C  (8).
Hoechst 33342 1000x Stock	Thermo Scientific	#62249	1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquot and store in dark, at 4°C for up to 1 year or at -20°C for long term storage. Prepare fresh  at 1 ug/mL (1x)
Isopentane, 99%	GFS Chemicals	#2961
Liquid Nitrogen
Paraformaldehyde (PFA) in PBS	Electron Microscopy Sciences	#15710	Prepared fresh 4% PFA from 16% PFA stock. Store the remaining 16% PFA at 4°C in the dark.
Permeabilization solution			PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3.  Prepare fresh.
Phosphate-buffered saline (PBS)	Bioworld	#41620015-20	0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4.  Prepared from 10x stock
Sucrose solutions	Fisher Scientific	#S-5-500	Dissolve the appropriate amount of sucrose in  37°C PBS (takes ~15 min to dissolve). May be stored for a few days at 4°C.
Tissue-Tek OCT-compound	Sakura	#4583
Antibodies	Company	Catalog Number	Comments
anti-calbindin	Sigma-Aldrich	C8666	To label horinzotal cells
anti-GAD65	Chemicon	AB5082	To label GABAergic amacrine cells
anti-GS	BD Transduction	610517	To label Müller cells
anti-rhodopsin	Millipore	MAB5316	To label rods