Preparazione delle sezioni ricrello della retina

Riepilogo

Questo rapporto descrive metodi completi per la preparazione di sezioni della retina del topo congelato per l'immunohistochimica (IHC). I metodi descritti includono la dissezione della coppa posteriore oculare, la fissazione della paraformaldeide, l'incorporamento nei supporti e nell'orientamento dei tessuti della temperatura di taglio ottimale (OCT), il sezionamento e l'immunostaining.

Abstract

La preparazione di sezioni oculari del topo di alta qualità per l'immunoistochimica (IHC) è fondamentale per valutare la struttura e la funzione della retina e per determinare i meccanismi alla base delle malattie retiniche. Mantenere l'integrità strutturale durante la preparazione dei tessuti è fondamentale per ottenere dati IHC retinici riproducibili, ma può essere difficile a causa della fragilità e della complessità della citoarchitettura retinica. Fissativi forti come 10% formalina o soluzione di Bouin preservare in modo ottimale la struttura della retina, spesso impediscono l'analisi IHC migliorando la fluorescenza di fondo e/ o diminuendo le interazioni anticorpo-epitope, un processo noto come mascheramento epitopiano. I fissativi più lievi, d'altra parte, come il 4% di paraformaldeide, riduce la fluorescenza di fondo e la mascheratura epitope, devono essere utilizzate tecniche di dissezione meticolose per preservare la struttura retinica. In questo articolo, presentiamo un metodo completo per preparare tazze posteriori oculari del topo per IHC che è sufficiente per preservare la maggior parte delle interazioni anticorpo-epitopo senza perdita di integrità strutturale retinica. Includiamo l'IHC rappresentativo con anticorpi a vari marcatori di tipo cellule retiniche per illustrare la conservazione e l'orientamento dei tessuti in condizioni ottimali e non ottimali. Il nostro obiettivo è ottimizzare gli studi IHC della retina fornendo un protocollo completo dalla dissezione della tazza posteriore oculare all'IHC.

Introduzione

L'immunohistochimica (IHC) è una potente tecnica per localizzare specifiche proteine e strutture cellulari nei tessuti in situ^1,2,3. Metodi di fissazione inappropriati e sezionamento non ottimale di tessuti complessi possono interrompere la struttura del tessuto, generare un'elevata colorazione di fondo o diminuire le interazioni anticorpo-epitopo, con conseguente colorazione artefatti e conseguente interpretazione errata di Dati IHC⁴. Poiché la retina vertebrata è un organo neurale complesso e altamente organizzato composto da strati di fotorecettori interconnessi, interneuroni e cellule gangliari, è molto fragile e può essere facilmente interrotto durante la dissezione e la sezionamento. Un protocollo dettagliato, standardizzato e convalidato dalla dissezione dell'occhio del mouse e dall'orientamento all'immunostaining contribuirà a ridurre significativamente gli artefatti IHC, aumentando così l'affidabilità dei risultati e consentendo dati comparativi più accurati analisi.

Ci sono molti protocolli per la preparazione dei tessuti per IHC, tuttavia, non tutti sono adatti per il tessuto retinica. Fissativi forti come 10% formalina o soluzione di Bouin preservare la struttura della retina durante la dissezione e sezionamento⁵. Sfortunatamente, forti fissativi spesso portano alla maggiore fluorescenza di fondo e mascheramento dell'epitopo a causa della modifica chimica degli epitopi⁶. D'altra parte, fissativi più miti, come 4% paraformaldeide (PFA) possono alleviare alcuni di questi artefatti, ma richiedono una dissezione meticolosa e la sezionamento per preservare la struttura della retina ottimale. Il PFA penetra rapidamente nel tessuto, ma si incrocia le proteine molto lentamente, riducendo il rischio di mascheramento dell'epitopo. Da breve tempo l'incubazione di PFA è una fissazione relativamente lieve, i tessuti spesso richiedono un congelamento rapido per preservare gli antigeni. È importante evitare la formazione di cristalli di ghiaccio durante il congelamento dei tessuti in quanto distorcono e danneggiano l'integrità delle cellule e dei tessuti⁷.

Qui descriviamo protocolli dettagliati e standardizzati per la dissezione, la fissazione e la crio-protezione delle tazze posteriori oculari del topo che producono dati IHC coerenti e affidabili.

Protocollo

Tutti i metodi qui descritti sono stati realizzati in stretta conformità con le raccomandazioni della Guida nazionale per la cura e l'uso degli animali da laboratorio fornite dall'Istituto di risorse animali da laboratorio e sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università della Pennsylvania.

Tutti gli strumenti e le attrezzature per i metodi sono illustrati nella Figura 1 ed elencati nella tabella dei materiali.

1 . Enucleazione dell'occhio del mouse, dissezione della coppa per gli occhi e incorporamento

1. Topi eutanasi con anidride carbonica (CO₂₎seguiti da decapitazione (topi postnatali P0 - P11) o lussazione cervicale (adulti >topi P11). Per i topi P0-P14, gli occhi sono coperti dalla pelle. Assicurarsi di rimuovere la pelle prima dei passaggi successivi.
2. Contrassegnare la parte temporale dell'occhio (Figura 2A) bruciando leggermente la cornea utilizzando un cauterizzatore di coda. Evitare di bruciare un buco nella cornea toccando la cornea con molta leggerezza e per non più di una frazione di secondo con il cauterizzatore.
3. Immediatamente enucleate occhi del topo utilizzando curve Dumont #5/45 pinze. Incubare per 15 min in un tubo criotubo da 1,5 mL con 1 mL del 4% di paraformaldeide (PFA) in salina tamponata da fosfato (PBS) sul ghiaccio.
4. Dopo 15 min nel 4% PFA, trasferire l'occhio fisso utilizzando le pinze curve Dumont #5/45 in un piatto di dissezione di 35 mm modificato (vedi Tabella dei materiali e Figura 1C) riempito con PBS e posto al microscopio dissezioso.
5. Fare una piccola incisione al segno di bruciatura, perpendicolare e appena sopra il limbo (bordo della cornea) utilizzando il micro coltello.
6. Inserire le forbici curve nell'incisione ed eseguire un taglio circonferenziale della cornea seguendo il limbo (Figura 2B).
7. Rimuovere la cornea ed estrarre la lente con un sottile Dumont #5 pinze, (Figura 2B) e sollevarlo delicatamente lontano dalla porzione posteriore dell'occhio. Il corpo vitreo, il gel trasparente che riempie lo spazio tra la lente e la retina, uscirà con l'obiettivo (Figura 2B) e la retina sarà visibile come una superficie bianca che copre l'interno della coppa dell'occhio posteriore. Assicurarsi che non vi siano danni visibili alla retina, come fori o strappi (Figura 2C).
8. Lavare le tazze per gli occhi due volte in 1 mL di PBS per 10 min a temperatura ambiente.
9. Cryoproteggere le tazze degli occhi equilibrandoli in una soluzione del 15% di saccarosio in PBS durante la notte a 4 gradi centigradi fino a quando la coppa per gli occhi affonda
10. Trasferire le tazze oculari al 30% di saccarosio in PBS per 2-3 h fino a quando la coppa occhio affonda.
11. Incorporare le tazze per gli occhi nello Strumento di personalizzazione di Office in criomicoli da 10 x 10 mm (Figura 3A). Utilizzando un microscopio sezionato, orientare l'occhio nel criomuffello lungo il suo asse dorsale-ventrale (Figura 2D, Figura 3A) ruotando l'occhio fino a quando il segno di ustione è in cima, il nervo ottico è a sinistra e la parte ritagliata dello stampo si affaccia a destra ( Figura 2D). Fare attenzione a evitare bolle vicino al tessuto.
    NOTA: Per manipolare la coppa oculare, utilizzare una sonda in titanio fatta di un filo di titanio attaccato a una punta di pipetta.
12. Per congelare il tessuto reticolare congelante, immergere il criostampo per almeno 5 min in un becher metallico contenente isopentane e posizionare il becher in azoto liquido o bagno di etanolo 100% (fino a 1/3 dell'altezza del bicchiere di metallo).
    NOTA: Il criostampo deve essere immerso in isopentane a più della metà della sua altezza, ma non deve essere completamente sommerso.
13. Rimuovere il blocco congelato e avvolgerlo in un foglio di alluminio.
14. Conservare a -80 gradi centigradi.
15. Contrassegnare il blocco bloccato utilizzando una penna o un'icona sharpie per registrare l'orientamento del blocco (Figura 3B).

2 . Sezionamento con criostati

1. Dopo aver regolato la temperatura criostat (tra -20 e -25 gradi centigradi), consentire agli stampi contenenti le tazze oculari incorporate di eclicare alla temperatura del criostato per 1 h.
2. Installare il blocco con orientamento dorso-ventrale (Figura 3C) e tagliare sezioni seriali spesse 10 m. Posizionare con attenzione le sezioni retiniche su vetrini al microscopio annotati e numerati.
3. Conservare i vetrini in scatole di diapositive a -20 o -80 gradi centigradi fino alle procedure IHC.

3 . Immunostaining a fluorescenza utilizzando il rack slide

NOTA: Il sistema Slide Rack (ad esempio, Sequenza) tiene i vetrini del microscopio in vetro con una piastra di copertura, creando uno spazio capillare di 100 dollari tra il vetrino e la piastra.

1. Scongelare le criosezioni a temperatura ambiente (RT) per 2 h a 4 h per consentire loro di asciugare e attaccare ai vetrini al microscopio.
   NOTA: È anche possibile asciugarli a 30-37 gradi centigradi per 30 min a 1 h.
2. Mettere i vetrini nel portadiapositive e lavare le sezioni della retina due volte in 100-200 - PBS per 2 min.
3. Permeabilizzare le sezioni retiniche incubandole nello 0,25% Triton-X / 0,05% NaN₃in PBS per 5 min a RT.
4. Aggiungere 100 - L di soluzione di blocco alle diapositive.
5. Aggiungere 100 l di anticorpo primario diluito in soluzione di blocco alle diapositive.
6. Incubare le sezioni della retina durante la notte a 4 gradi centigradi.
   NOTA: Durante questo periodo, coprire il rack di scorrimento per evitare la disidratazione delle sezioni.
7. Lavare le sezioni della retina 3 volte, ciascuna per 15 min, utilizzando 200 PBS.
   NOTA: l'aggiunta da 0,001- 0,002% da Triton-X100 a PBS (PBS-T) consente un lavaggio più rigoroso, ma può interrompere alcune membrane e strutture cellulari.
8. Incubare sezioni retiniche in anticorpi secondari con etichetta fluorescente per 1 h a RT. D'ora in eora proteggiti dalla luce.
9. Lavare le sezioni della retina 3 volte, ciascuna per 15 min.
10. Incubare le sezioni retiniche a RT per 5 min con un marcatore nucleare come Hoechst 33342 o soluzione DAPI.
11. Lavare le sezioni della retina 1 volta per 15 min.
12. Posizionare un coperchio sopra un tovagliolo di carta sulla panca del laboratorio.
13. Aggiungere 2 gocce di supporto di montaggio anti-dissolvenza al centro della coverslip.
14. Girare la diapositiva per avere il crio-sezione retina rivolta verso il basso.
15. Montare con cura il coperchio lentamente, con un angolo di 45 gradi, puntare la diapositiva sul supporto di montaggio.
    NOTA: Evitare di formare bolle come si abbassa la diapositiva in posizione.
16. Applicare una pressione uniforme, utilizzando un libro pesante o un catalogo (vedi sotto), alla combinazione slide-coverslip per eliminare il supporto di montaggio in eccesso.
    NOTA: per garantire la coerenza nella preparazione del campione, utilizzare sempre lo stesso oggetto (cioè lo stesso libro o catalogo) per applicare una pressione uniforme alla vetritta durante il montaggio delle diapositive.
17. Mantenere piatto e lasciare indurire durante la notte a RT al buio. Conservare i vetrini a 4 gradi centigradi a tempo indeterminato.
18. Immagine tramite campo largo o microscopia a fluorescenza confocale (Figura 4).

Risultati

Per illustrare come questi protocolli, garantire la conservazione ottimale della retina per IHC, abbiamo sondato le sezioni retiniche da topi P28 WT (C57BL/6N) con anticorpi a rodopsina (un marcatore fotorecettore)⁸, acido glutammico decarboxylase 65 (Gad65, una cellula amacina marcatore)⁹, sintetasi di glutammina (GS, un marcatore di cellule M-ller)¹⁰e calbindin (un marcatore di cella orizzontale)^11...

Discussione

La dissezione della retina del topo è un processo delicato a causa delle piccole dimensioni e della forma degli occhi del topo e della fragilità del tessuto retinica. Anche se eseguire dissezione di alta qualità è una questione di pratica, avere un protocollo dettagliato, fornire metodi e suggerimenti efficienti è una necessità per ottenere sezioni retiniche e IHC. Oltre ai protocolli descritti qui, ci sono diversi suggerimenti che consentono sezioni retiniche coerenti di alta qualità che sono adatti per IHC ripro...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
6qt. Stainless Steel Beaker (185 x 218mm)	Gilson	#MA-48	For liquid nitrogen (Figure 1E)
Aluminum foil
Cauterizer	Bovie	#AA01	To mark eye orientation (Figure 1A)
Curved forceps, Dumont #5/45 tweezers, 45-degrees bent	Electron Microscopy Sciences	#72703-D	For mouse eye enucleation and maintenance (Figure 1A)
Curved scissors, Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge	Fine Science Tools	#15002-08	To circumferentially cut the cornea (Figure 1B)
Dental wax-coated 35mm dissection dish			For eye cup dissection (Figure 1C)
Dissecting microscope	Leica, Houston, USA	MZ12.5 High-performance stereomicroscope
Micro Knives - Plastic Handle	Fine Science Tools	#10315-12	To make a small incision at the burn mark (Figure 1A)
Pink dental wax	Electron Microscopy Sciences	#72660	For coating dissection dish
Slide Rack and Coverplate	Ted Pella	#36107	For retinal IHC (Figure 1G)
Stainless Steel Beaker (89 x 114mm)	Gilson	#MA-40	For isopentane bath (Figure 1E)
Styrofoam box			For insulated cooler
Thin forceps Dumont #5	Fine Science Tools	#11254-20	To remove the cornea and extract the lens (Figure 1B)
Tissue-Tek cryomold  (10mm x 10mm x 5mm)	Electron Miscroscopy Sciences	#62534-10	Mold for OCT embedding
Buffers and Reagents	Company	Catalog Number	Comments
Blocking solution			2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in permeabilization buffer.
Gelvatol (anti-fading mounting media)			Under the fume hood, dissolve 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01).  Adjust to pH 8-8.5 with 12N HCl (~ 5 drops).  Store in amber drop bottle at 4°C  (8).
Hoechst 33342 1000x Stock	Thermo Scientific	#62249	1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquot and store in dark, at 4°C for up to 1 year or at -20°C for long term storage. Prepare fresh  at 1 ug/mL (1x)
Isopentane, 99%	GFS Chemicals	#2961
Liquid Nitrogen
Paraformaldehyde (PFA) in PBS	Electron Microscopy Sciences	#15710	Prepared fresh 4% PFA from 16% PFA stock. Store the remaining 16% PFA at 4°C in the dark.
Permeabilization solution			PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3.  Prepare fresh.
Phosphate-buffered saline (PBS)	Bioworld	#41620015-20	0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4.  Prepared from 10x stock
Sucrose solutions	Fisher Scientific	#S-5-500	Dissolve the appropriate amount of sucrose in  37°C PBS (takes ~15 min to dissolve). May be stored for a few days at 4°C.
Tissue-Tek OCT-compound	Sakura	#4583
Antibodies	Company	Catalog Number	Comments
anti-calbindin	Sigma-Aldrich	C8666	To label horinzotal cells
anti-GAD65	Chemicon	AB5082	To label GABAergic amacrine cells
anti-GS	BD Transduction	610517	To label Müller cells
anti-rhodopsin	Millipore	MAB5316	To label rods