Préparation de la souris Retinal Cryo-sections pour l'immunohistochimie

Résumé

Ce rapport décrit des méthodes complètes pour préparer les sections congelées de rétine de souris pour l'immunohistochimie (IHC). Les méthodes décrites incluent la dissection de la tasse postérieure oculaire, la fixation de paraformaldehyde, l'intégration dans la température de coupe optimale (OCT) orientation de médias et de tissu, sectionnement et immunostaining.

Résumé

La préparation de sections oculaires de souris de haute qualité pour l'immunohistochimie (IHC) est essentielle pour évaluer la structure et la fonction rétiniennes et pour déterminer les mécanismes sous-jacents aux maladies rétiniennes. Le maintien de l'intégrité structurelle tout au long de la préparation des tissus est essentiel pour obtenir des données reproductibles du CIH rétinien, mais peut être difficile en raison de la fragilité et de la complexité de la cytoarchitecture rétinienne. Des fixatifs forts comme la formaline de 10 % ou la solution de Bouin préservent de façon optimale la structure rétinienne, ils entravent souvent l'analyse du CiSE en améliorant la fluorescence de fond et/ou en diminuant les interactions anticorps-épitopes, un processus connu sous le nom de masquage épitope. Les fixatifs plus doux, d'autre part, comme le paraformaldéhyde de 4%, réduit la fluorescence de fond et les techniques méticuleuses de dissection d'épitope-masquant doivent être employées pour préserver la structure rétinienne. Dans cet article, nous présentons une méthode complète pour préparer des tasses postérieures oculaires de souris pour IHC qui est suffisante pour préserver la plupart des interactions anticorps-épitope sans perte de l'intégrité structurale rétinienne. Nous incluons le CiPH représentatif avec des anticorps à divers marqueurs de type de cellules rétiniennes pour illustrer la conservation et l'orientation de tissu dans des conditions optimales et sous-optimales. Notre objectif est d'optimiser les études IHC de la rétine en fournissant un protocole complet de la dissection oculaire de tasse postérieure à IHC.

Introduction

L'immunohistochimie (IHC) est une technique puissante pour localiser des protéines spécifiques et des structures cellulaires dans les tissus in situ^1,2,3. Des méthodes de fixation inappropriées et une section sous-optimale de tissus complexes peuvent perturber la structure des tissus, générer une coloration de fond élevée ou diminuer les interactions anticorps-épitopètes, ce qui entraîne la coloration d'artefacts et, par conséquent, une mauvaise interprétation des Données du CSI⁴. Comme la rétine des vertébrés est un organe neuronal complexe et très organisé composé de strates de photorécepteurs interconnectés, d'interneurones et de cellules ganglionnaires, il est très fragile et peut être facilement perturbé lors de la dissection et de la section. Un protocole détaillé, normalisé et validé, de la dissection et de l'orientation des yeux de souris à l'immunostaining, aidera à réduire considérablement les artefacts du CiSE, ce qui augmentera la fiabilité des résultats et permettra d'obtenir des données comparatives plus précises. analyse.

Il existe de nombreux protocoles pour la préparation des tissus pour le CiSE, cependant, tous ne sont pas adaptés pour le tissu rétinien. Des fixatifs solides comme la formaline de 10 % ou la solution de Bouin préservent la structure rétinienne pendant la dissection et la section⁵. Malheureusement, les fixatifs forts mènent souvent à la fluorescence de fond amélioréeet au masquage d'épitope dû à la modification chimique des épitopes 6. D'autre part, des fixatifs plus doux, comme le paraformaldéhyde (PFA) de 4 %, peuvent soulager certains de ces artefacts, mais nécessitent une dissection méticuleuse et des sections pour préserver la structure rétinienne optimale. PfA pénètre rapidement les tissus, mais les protéines transversales très lentement, réduisant le risque de masquage épitope. Étant donné que l'incubation de PFA de courte durée est une fixation relativement légère, les tissus nécessitent souvent une congélation rapide pour préserver les antigènes. Il est important d'éviter la formation de cristaux de glace pendant la congélation des tissus car ils déforment et endommagent l'intégrité des cellules et des tissus⁷.

Ici nous décrivons des protocoles détaillés et normalisés pour la dissection, la fixation, et la cryo-protection des tasses postérieures oculaires de souris qui donnent des données cohérentes et fiables de IHC.

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été mises en œuvre dans le strict respect des recommandations du Guide national des instituts de santé pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire fournis par l'Institut des ressources animales de laboratoire et ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Université de Pennsylvanie.

Tous les outils et équipements pour les méthodes sont indiqués à la figure 1 et énumérés dans le tableau des matériaux.

1 . Enucleation d'oeil de souris, dissection de tasse d'oeil, et incorporation

1. Euthanasier les souris avec du dioxyde de carbone (CO₂) suivie soit de la décapitation (souris postnatales P0 - P11) ou de la dislocation cervicale (souris adultes .Gt;P11). Pour les souris P0-P14, les yeux sont couverts par la peau. Assurez-vous d'enlever la peau avant les étapes suivantes.
2. Marquer la partie temporelle de l'œil (Figure 2A) en brûlant légèrement la cornée à l'aide d'un cautérisateur pour la queue. Évitez de brûler un trou dans la cornée en touchant la cornée très légèrement et pour pas plus d'une fraction de seconde avec le cautérisateur.
3. Enucleate immédiatement les yeux de souris en utilisant courbé Dumont #5/45 forceps. Incuber 15 min dans un tube cryotube de 1,5 ml avec 1 ml de paraformaldéhyde (PFA) de 4 % dans de la saline tamponnée en phosphate (PBS) sur la glace.
4. Après 15 min en 4 % de PFA, transférez l'œil fixe à l'aide des forceps courbes Dumont #5/45 à un plat de dissection modifié de 35 mm (voir Tableau des matériaux et Figure 1C)rempli de PBS et placez-le sous microscope disséquant.
5. Faire une petite incision à la marque de brûlure, perpendiculaire à et juste au-dessus du limbe (frontière de la cornée) à l'aide du micro couteau.
6. Insérez les ciseaux incurvés dans l'incision et effectuez une coupe circonférence de la cornée après le limbus (Figure 2B).
7. Retirez la cornée et extrayez la lentille avec un mince Dumont #5 forceps, (Figure 2B) et soulevez-la délicatement loin de la partie postérieure de l'œil. Le corps vitré, le gel clair qui remplit l'espace entre la lentille et la rétine, sortira avec la lentille (Figure 2B) et la rétine sera visible comme une surface blanche couvrant l'intérieur de la tasse oculaire postérieure. Assurez-vous qu'il n'y a pas de dommages visibles à la rétine, comme des trous ou des déchirures (figure 2C).
8. Laver les gobelets deux fois en 1 ml de PBS pendant 10 min à température ambiante.
9. Cryoprotégez les tasses pour les yeux en les équilibrant dans une solution de 15% de saccharose en PBS pendant la nuit à 4 oC jusqu'à ce que la tasse pour les yeux coule
10. Transférer les gobelets oculaires à 30% de saccharose en PBS pendant 2-3 h jusqu'à ce que la tasse d'oeil coule.
11. Intégrez les gobelets en OCT dans des cryomolds de 10 x 10 mm (Figure 3A). À l'aide d'un microscope à disséquer, orientez l'œil dans le cryomold le long de son axe dorsal-ventral (Figure 2D, Figure 3A) en tournant l'œil jusqu'à ce que la marque de brûlure soit sur le dessus, le nerf optique est sur la gauche et la partie découpée du moule fait face à la droite ( Figure 2D). Prenez soin d'éviter les bulles près du tissu.
    REMARQUE : Pour manipuler la tasse d'oeil, utilisez une sonde de titane faite d'un fil de titane attaché à une pointe de pipette.
12. Pour congeler le tissu rétinien, immerger le cryomold pendant au moins 5 min dans un bécher métallique contenant de l'isopentane et placer le bécher dans de l'azote liquide ou de la glace sèche/100% de bain d'éthanol (jusqu'à 1/3 de la hauteur du bécher en métal).
    REMARQUE : Le cryomold doit être immergé dans l'isopentane à plus de la moitié de sa hauteur, mais ne doit pas être complètement submergé.
13. Retirer le bloc congelé et l'envelopper dans du papier d'aluminium.
14. Conserver à -80 oC.
15. Marquez le bloc gelé à l'aide d'un stylo ou d'un sharpie pour enregistrer l'orientation du bloc (Figure 3B).

2 . Sectionàr à l'aide d'un cryostat

1. Après ajustement de la température du cryostat (entre -20 et -25 oC), laissez les moules contenant les gobelets pour les yeux intégrés à l'équilibre à la température du cryostat pendant 1 h.
2. Installez le bloc avec l'orientation dorso-ventrale (figure 3C) et coupez 10 sections de série d'épaisseur de 10 m. Placez soigneusement les sections rétiniennes sur des lames de microscope annotées et numérotées.
3. Conservez les diapositives dans des boîtes à glissière à -20 oC ou à 80 oC jusqu'aux procédures du CSI.

5 h Immunostaining de fluorescence utilisant le glissière

REMARQUE : Le système slide Rack (p. ex. Sequenza) tient les lames de microscope en verre avec une plaque de couverture, créant ainsi un espace capillaire de 100 livres et un trou entre la glissière et la plaque.

1. Décongeler les cryosections à température ambiante (RT) de 2 h à 4 h pour les laisser sécher et les attacher aux lames de microscope.
   REMARQUE : Il est également possible de les sécher à 30-37 oC pendant 30 min à 1 h.
2. Placez les glissières dans slide Rack et lavez les sections rétiniennes deux fois en 100-200 L PBS pendant 2 min.
3. Perméabilisez les sections rétiniennes en les incubant dans 0.25% Triton-X / 0.05% NaN₃dans PBS pendant 5 min à RT.
4. Ajouter 100 l de solution de blocage aux diapositives.
5. Ajouter 100 l d'anticorps primaires dilués dans la solution de blocage des diapositives.
6. Incuber les sections rétiniennes pendant la nuit à 4 oC.
   REMARQUE : Pendant ce temps, couvrez le slide Rack pour éviter la dessiccation des sections.
7. Laver les sections rétiniennes 3 fois, chacune pendant 15 min, à l'aide de 200 L DEPBS.
   REMARQUE: L'ajout de 0,001- 0,002% Triton-X100 à PBS (PBS-T) permettent un lavage plus rigoureux, mais peut perturber certaines membranes et les structures cellulaires.
8. Incuber les sections rétiniennes dans des anticorps secondaires fluorescents pendant 1 h à RT. Dorénavant, protégez-vous de la lumière.
9. Laver les sections rétiniennes 3 fois, chacune pendant 15 min.
10. Incuber les sections rétiniennes à RT pendant 5 min avec un marqueur nucléaire tel que Hoechst 33342 ou la solution DAPI.
11. Laver les sections rétiniennes 1 fois pendant 15 min.
12. Placez un bordereau sur une serviette en papier sur le banc du laboratoire.
13. Ajouter 2 gouttes de supports de montage anti-fading au centre de la couverture.
14. Retournez la glissière pour que la cryosection rétinienne soit orientée vers le bas.
15. Montez soigneusement la glissière de couverture lentement, à un angle de 45 degrés, faites pencher la glissière sur le support de montage.
    REMARQUE : Éviter de former des bulles lorsque vous abaissez la glissière en place.
16. Appliquer une pression uniforme, à l'aide d'un livre ou d'un catalogue lourd (voir ci-dessous), sur la combinaison slide-coverslip pour éliminer l'excès de supports de montage.
    REMARQUE : Pour assurer la cohérence dans la préparation de l'échantillon, utilisez toujours le même objet (c.-à-d. le même livre ou catalogue) pour appliquer une pression uniforme sur la glissière pendant le montage de la diapositive.
17. Garder à plat et laisser durcir toute la nuit à RT dans l'obscurité. Stockez les toboggans à plat à 4 oC indéfiniment.
18. Image via un champ large ou une microscopie à fluorescence confocale (figure 4).

Résultats

Pour illustrer comment ces protocoles, assurer la conservation rétinienne optimale pour IHC, nous avons sondé les sections rétiniennes des souris P28 WT (C57BL/6N) avec des anticorps à la rhodopsine (un marqueur photorécepteur)⁸, décarboxylase d'acide glutamique 65 (Gad65, cellule amacrine marqueur)⁹, la glutamine synthetase (GS, un marqueur cellulaire de M-ller)¹⁰, et la calbindine (un marqueur cellulaire horiz...

Discussion

La dissection de la rétine de la souris est un processus délicat en raison de la petite taille et la forme des yeux de souris et de la fragilité du tissu rétinien. Même si la dissection de haute qualité est une question de pratique, avoir un protocole détaillé, fournir des méthodes et des conseils efficaces est une nécessité pour obtenir des sections rétiniennes et IHC. En plus des protocoles décrits ici, il y a plusieurs bouts qui tiennent des sections rétiniennes cohérentes de haute qualité qui convienn...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
6qt. Stainless Steel Beaker (185 x 218mm)	Gilson	#MA-48	For liquid nitrogen (Figure 1E)
Aluminum foil
Cauterizer	Bovie	#AA01	To mark eye orientation (Figure 1A)
Curved forceps, Dumont #5/45 tweezers, 45-degrees bent	Electron Microscopy Sciences	#72703-D	For mouse eye enucleation and maintenance (Figure 1A)
Curved scissors, Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge	Fine Science Tools	#15002-08	To circumferentially cut the cornea (Figure 1B)
Dental wax-coated 35mm dissection dish			For eye cup dissection (Figure 1C)
Dissecting microscope	Leica, Houston, USA	MZ12.5 High-performance stereomicroscope
Micro Knives - Plastic Handle	Fine Science Tools	#10315-12	To make a small incision at the burn mark (Figure 1A)
Pink dental wax	Electron Microscopy Sciences	#72660	For coating dissection dish
Slide Rack and Coverplate	Ted Pella	#36107	For retinal IHC (Figure 1G)
Stainless Steel Beaker (89 x 114mm)	Gilson	#MA-40	For isopentane bath (Figure 1E)
Styrofoam box			For insulated cooler
Thin forceps Dumont #5	Fine Science Tools	#11254-20	To remove the cornea and extract the lens (Figure 1B)
Tissue-Tek cryomold  (10mm x 10mm x 5mm)	Electron Miscroscopy Sciences	#62534-10	Mold for OCT embedding
Buffers and Reagents	Company	Catalog Number	Comments
Blocking solution			2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in permeabilization buffer.
Gelvatol (anti-fading mounting media)			Under the fume hood, dissolve 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01).  Adjust to pH 8-8.5 with 12N HCl (~ 5 drops).  Store in amber drop bottle at 4°C  (8).
Hoechst 33342 1000x Stock	Thermo Scientific	#62249	1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquot and store in dark, at 4°C for up to 1 year or at -20°C for long term storage. Prepare fresh  at 1 ug/mL (1x)
Isopentane, 99%	GFS Chemicals	#2961
Liquid Nitrogen
Paraformaldehyde (PFA) in PBS	Electron Microscopy Sciences	#15710	Prepared fresh 4% PFA from 16% PFA stock. Store the remaining 16% PFA at 4°C in the dark.
Permeabilization solution			PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3.  Prepare fresh.
Phosphate-buffered saline (PBS)	Bioworld	#41620015-20	0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4.  Prepared from 10x stock
Sucrose solutions	Fisher Scientific	#S-5-500	Dissolve the appropriate amount of sucrose in  37°C PBS (takes ~15 min to dissolve). May be stored for a few days at 4°C.
Tissue-Tek OCT-compound	Sakura	#4583
Antibodies	Company	Catalog Number	Comments
anti-calbindin	Sigma-Aldrich	C8666	To label horinzotal cells
anti-GAD65	Chemicon	AB5082	To label GABAergic amacrine cells
anti-GS	BD Transduction	610517	To label Müller cells
anti-rhodopsin	Millipore	MAB5316	To label rods