הכנת שאיפה של העכבר רשתית-סעיפים עבור אימונוהיסטוכימיה

Summary

דו ח זה מתאר שיטות מקיפות של הכנת העכבר הקפוא מקטעים רשתית עבור אימונוהיסטוכימיה (IHC). השיטות שתוארו כוללות ניתוח של הספל האחורי העינית, קיבעון הפרפורמלדהיד, הטבעה של טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) מדיה ורקמות כיוון, הסרת וכתמים חיסוני.

Abstract

הכנת סעיפים באיכות גבוהה עכבר העין עבור אימונוהיסטוכימיה (IHC) הוא קריטי להערכת מבנה ותפקוד רשתית ולקביעת מנגנונים המשמשים מחלות רשתית. שמירה על השלמות המבנית לאורך הכנת הרקמה חיונית להשגת נתונים ברשתית שניתן לתחזק, אך יכול להיות מאתגר בשל שבריאת והמורכבות של האדריכלות הרשתית. תיקונים חזקים כמו 10% פורמלין או הפתרון של bouin לשמר בצורה אופטימלית את המבנה הרשתית, הם לעתים קרובות לעכב את ניתוח ihc על ידי שיפור הרקע של זריחה ו/או הפוחתת נוגדן האינטראקציות, תהליך המכונה מיסוך אפירופה. תיקונים מתון יותר, מצד שני, כמו 4% פאראפורמלדהיד, מפחית את הרקע של זריחה ואפירופה-מיסוך, טכניקות הניתוח מוקפד חייב להיות מנוצל כדי לשמר את המבנה הרשתית. במאמר זה, אנו מציגים שיטה מקיפה כדי להכין את העכבר כוסות האחורי העינית עבור IHC כי הוא מספיק כדי לשמר את האינטראקציות הנוגדן ביותר מבלי לאבד שלמות מבנית ברשתית. אנו כוללים נציג IHC עם נוגדנים שונים סוג תא סמנים ברשתית כדי להמחיש שימור רקמות וכיוון בתנאים מיטביים ותת אופטימלית. המטרה שלנו היא לייעל את מחקרי IHC של הרשתית על ידי מתן פרוטוקול מלאה מתוך ניתוח הספל האחורי העינית ל-IHC.

Introduction

אימונוהיסטוכימיה (ihc) היא טכניקה רבת-עוצמה לאיתור חלבונים ומבני סלולר ספציפיים ברקמות באתרו^1,2,3. שיטות קיבעון בלתי הולמים והפחתה תת-אופטימלית של רקמות מורכבות יכול לשבש את מבנה הרקמה, ליצור כתמים ברקע גבוה או להפחית נוגדן-אפירופה אינטראקציות, וכתוצאה מכך מכתים חפצים והסוגר וטעה של נתוני IHC⁴. כמו הרשתית בעלי החוליות הוא איבר עצבי מורכב ומאורגן מאוד מורכב משכבות של פוטוטורקטורים מחוברים, הביננוירונים ותאים גנגליון, זה שברירי מאוד ניתן לשבש בקלות במהלך הניתוח והפריית. פרוטוקול מפורט, מתוקננת, ומאומת מפני הפחתת עין העכבר והתמצאות לכתמים מסייעים להפחית באופן משמעותי את הממצאים של IHC, ובכך להגדיל את האמינות של התוצאות ולאפשר נתונים השוואתיים יותר מדויקים ניתוח.

ישנם פרוטוקולים רבים עבור הכנת רקמות עבור IHC, עם זאת, לא כל מתאים לרקמות רשתית. תיקונים חזקים כמו 10% פורמלין או הפתרון של bouin לשמר את המבנה הרשתית במהלך הניתוח והאפשרות⁵. למרבה הצער, תיקונים חזקים מובילים לעיתים קרובות לאור הזריחה המשופרת והמסיכה כתוצאה משינוי כימי של אפיסקופים⁶. מצד שני, תיקונים מתון יותר, כמו 4% פאראמפורמלדהיד (בתחתית) יכולים להקל על כמה מהחפצים האלה, אבל דורשים לעבור ניתוח קפדני והקפדה כדי לשמר את המבנה הרשתית האופטימלי. הכדורגלן חודר במהירות לרקמות, אבל מצמצמים את החלבונים מאוד לאט, ומפחיתים את הסיכון של הסוואה. מאז הדגירה התחתית זמן קצר היא קיבעון קל יחסית, רקמות לעתים קרובות דורשים קיפאון מהיר כדי לשמר אנטיגנים. חשוב להימנע היווצרות גביש הקרח במהלך הקפאת רקמות כפי שהם לעוות ולפגוע היושרה של תאים ורקמות⁷.

כאן אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים וסטנדרטיים עבור ניתוח, קיבעון, הגנה על ההקפאה של כוסות העכבר האחורי העינית התשואה נתונים IHC עקבית ואמין.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן בוצעו בהתאמה קפדנית עם ההמלצות של המכונים הלאומיים למדריך בריאות לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה שסופקו על ידי המכון למשאבי בעלי חיים במעבדה ואושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים והוועדה השתמש של אוניברסיטת פנסילבניה.

כל הכלים והציוד עבור השיטות מוצגים באיור 1 ומפורטים בטבלת החומרים.

1. העין העכבר enucleation, העין לנתיחה, והטבעה

1. המתת חסד של עכברים עם פחמן דו חמצני (CO₂) ואחריו עריפת ראש (עכברים לפני הלידה P0-P11) או פריקה צוואר הרחם (למבוגרים > P11 עכברים). עבור עכברים P0-P14, העיניים מכוסות בעור. הקפידו להסיר את העור לפני הצעדים הבאים.
2. סמן את החלק הזמני של העין (איור 2 א) על ידי שריפת הקרנית מעט באמצעות הזנב צורב. הימנע בוער חור בקרנית ידי נגיעה בקרנית בקלילות מאוד וללא יותר משבריר שנייה עם הצורב.
3. מיד עוקרים את עיני העכבר באמצעות מעוקל דומונט5/45 מלקחיים. מודרת עבור 15 דקות ב 1.5 mL שפופרת קריוצינור עם 1 מ ל של 4% פאראפורמלדהיד (בתחתית) ב-פוספט מאגור מלוחים (PBS) על קרח.
4. לאחר 15 דקות ב 4% כלגון, להעביר את העין הקבועה באמצעות מלקחיים מעוקל דומונט5/45 כדי שונה 35 מ"מ צלחת הניתוח (ראה טבלת חומרים ואיור 1c) מלא PBS ו מקום תחת מיקרוסקופ.
5. לעשות חתך קטן על סימן הכוויה, בניצב אל וקצת מעל לימבוס (הגבול של הקרנית) באמצעות סכין מיקרו.
6. הכנס את המספריים המעוקל לתוך החתך ולבצע חתך מעוקל של הקרנית בעקבות לימבוס (איור 2B).
7. הסר את הקרנית ולחלץ את העדשה עם דק5 מלקחיים דומונט, (איור 2B) ולהרים אותו בעדינות הרחק מהחלק האחורי של העין. הגוף אינדקטור, ג'ל ברור הממלא את החלל בין העדשה ואת הרשתית, תצא עם העדשה (איור 2b) ואת הרשתית יהיה גלוי כמו משטח לבן המכסה את החלק הפנימי של העין האחורי של הספל. ודא כי אין נזק גלוי לעין הרשתית, כגון חורים או דמעות (איור 2C).
8. שטוף את כוסות העיניים פעמיים ב 1 מ ל של PBS עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר.
9. הקפאה של כוסות העין על ידי השתלטות עליהם בתמיסה של 15% סוכרוז ב-PBS לילה ב-4 ° צ' עד לכיורי העיניים
10. להעביר את כוסות העין כדי 30% סוכרוז ב-PBS עבור 2-3 h עד כיורי העין שוקעת.
11. להטביע את כוסות העין ב OCT ב 10 x 10 מילימטר cryomolds (איור 3a). באמצעות מיקרוסקופ מבתר, כוון את העין בקריואוולד לאורך הציר הגוגולי שלה (איור 2D, איור 3a) על ידי סיבוב העין עד סימן הכוויה הוא למעלה, עצב הראייה הוא בצד שמאל, חלק לחתוך את העובש פונה ימינה ( איור 2D). שמור על עצמך להימנע בועות ליד הרקמה.
    הערה: כדי לתמרן את גביע העין, להשתמש במקדח טיטניום עשוי חוט טיטניום המצורפת לקצה הפיפטה.
12. כדי להצמיד הקפאת רקמת הרשתית, לטבול את cryomold לפחות 5 דקות בגביע מתכת המכיל איזופנטאן ולמקם את הגביע בחנקן נוזלי או קרח יבש/100% האתנול אמבטיה (עד 1/3 של גובה גביע המתכת).
    הערה: cryomold צריך להיות שקוע איזופנטאן לגדול ממחצית הגובה שלה, אבל לא צריך להיות לגמרי שקוע.
13. להסיר את הבלוק הקפוא לעטוף אותו רדיד אלומיניום.
14. חנות ב-80 ° c.
15. סמן את הבלוק הקפוא באמצעות עט או טוש כדי להקליט את כיוון הבלוק (איור 3B).

2. בנייה באמצעות קריוסטט

1. לאחר התאמת טמפרטורת הקריוסטט (בין-20 ל-25 ° c), אפשר את התבניות המכילות את כוסות העיניים המוטבעות כדי להתאים את טמפרטורת הקריוסטט ל-1 h.
2. התקן את הבלוק עם כיוון dorso-ventral (איור 3c) ולחתוך 10 יקרומטר מקטעים סידוריים עבים. מניחים בזהירות את החלקים הרשתית על שקופיות המיקרוסקופ ממוספרים.
3. אחסן שקופיות בתיבות שקופיות ב-20 ° צ' או-80 ° צ' עד להליכי IHC.

3. כתמים פלואורסצנטית באמצעות מתלה השקופיות

הערה: מערכת לארון תקשורת שקופית (למשל, סקונצה) מחזיקה את שקופיות מיקרוסקופ הזכוכית עם צלחת כיסוי, יצירת פער הנימים ~ 100 μL בין השקופית לצלחת.

1. להפשיר את מקטעי ההקפאה בטמפרטורת החדר (RT) עבור 2 h כדי 4 h כדי לאפשר להם להתייבש ולצרף לשקופיות מיקרוסקופ.
   הערה: ניתן גם לייבש אותם ב 30-37 ° c עבור 30 דקות עד 1 h.
2. מקם שקופיות בארון תקשורת של השקופיות ושטוף את מקטעי הרשתית פעמיים ב-100-200 μL PBS עבור 2 דקות.
3. החדירות סעיפים ברשתית על ידי מודטת אותם ב 0.25% טריטון-X/0.05% נאן₃ב PBS עבור 5 דקות ב-RT.
4. הוסף 100 μL של חסימת פתרון לשקופיות.
5. הוסף 100 μL של הנוגדן העיקרי מדולל בפתרון חסימת לשקופיות.
6. מודריטה סעיפים רשתית לילה ב 4 ° c.
   הערה: במהלך זמן זה, כסה את מתלה השקופיות כדי למנוע התייבשות של המקטעים.
7. לשטוף את מקטעי הרשתית 3 פעמים, כל אחד עבור 15 דקות, באמצעות 200 μL PBS.
   הערה: התוספת של 0.001-0.002% טריטון-X100 כדי PBS (PBS-T) לאפשר שטיפה מחמירה יותר, אבל יכול לשבש כמה קרומים ומבנים סלולריים.
8. דגירה סעיפים הרשתית בנוגדנים המסומנים על ידי פלורסנט עבור 1 h ב RT. . מעתה והלאה, הגן מפני האור
9. שטוף את מקטעי הרשתית 3 פעמים, כל אחד עבור 15 דקות.
10. מודאת סעיפים ברשתית ב RT עבור 5 דקות עם סמן גרעיני כגון Hoechst 33342 או פתרון DAPI.
11. לשטוף את סעיפים הרשתית 1 פעם עבור 15 דקות.
12. הניחו שמיכות על גבי מגבת נייר על ספסל המעבדה.
13. הוסף 2 טיפות של המדיה הרכבה אנטי נמוגה למרכז הכיסויים.
14. הפוך את השקופית כדי שמקטע ההקפאה הרשתית פונה כלפי מטה.
15. הבהר בזהירות את הכיסויים, בזווית של ~ 45 °, הקצה את השקופית אל המדיה הנכנסת.
    הערה: הימנעות מיצירת בועות בעת הורדת השקופית במקומה.
16. החלת לחץ אפילו, באמצעות ספר או קטלוג כבדים (ראה להלן), לשילוב שקופית-שקופיות כדי למנוע הרכבה מדיה עודפת.
    הערה: כדי להבטיח עקביות בהכנה לדוגמה, השתמש תמיד באותו אובייקט, (כלומר, אותו ספר או קטלוג) כדי להחיל לחץ אפילו על הכיסויים במהלך הרכבת השקופיות.
17. שמרו על שטוח והניחו את הלילה בחושך בחשיכה. אחסן מגלשות שטוחות ב -4 ° c ללא הגבלת זמן.
18. תמונה באמצעות שדה רחב או המיקרוסקופיה פלואורסצנטית (איור 4).

תוצאות

כדי להמחיש כיצד פרוטוקולים אלה, להבטיח שימור הרשתית אופטימלית עבור ihc, אנו בדקו מקטעים ברשתית מ P28 WT עכברים (C57BL/6n) עם נוגדנים לרודוסין (הסמן תא קולט אור)⁸, גלוטמית חומצה decarboxylase 65 (Gad65, תא אמקרין marker)⁹, גלוטמין הבורסה (GS, מסמן תא מולר)¹⁰, ו calb...

Discussion

לנתיחה הרשתית של העכבר הוא תהליך עדין בשל גודל קטן וצורה של עיניים העכבר ושבריאת הרקמות הרשתית. למרות ביצוע הניתוח באיכות גבוהה הוא עניין של תרגול, בעל פרוטוקול מפורט, מתן שיטות יעילות וטיפים הוא הכרח להשיג חלקים ברשתית ו-IHC. בנוסף לפרוטוקולים המתוארים כאן, קיימים מספר טיפים המאפשרים למקטע...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6qt. Stainless Steel Beaker (185 x 218mm)	Gilson	#MA-48	For liquid nitrogen (Figure 1E)
Aluminum foil
Cauterizer	Bovie	#AA01	To mark eye orientation (Figure 1A)
Curved forceps, Dumont #5/45 tweezers, 45-degrees bent	Electron Microscopy Sciences	#72703-D	For mouse eye enucleation and maintenance (Figure 1A)
Curved scissors, Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge	Fine Science Tools	#15002-08	To circumferentially cut the cornea (Figure 1B)
Dental wax-coated 35mm dissection dish			For eye cup dissection (Figure 1C)
Dissecting microscope	Leica, Houston, USA	MZ12.5 High-performance stereomicroscope
Micro Knives - Plastic Handle	Fine Science Tools	#10315-12	To make a small incision at the burn mark (Figure 1A)
Pink dental wax	Electron Microscopy Sciences	#72660	For coating dissection dish
Slide Rack and Coverplate	Ted Pella	#36107	For retinal IHC (Figure 1G)
Stainless Steel Beaker (89 x 114mm)	Gilson	#MA-40	For isopentane bath (Figure 1E)
Styrofoam box			For insulated cooler
Thin forceps Dumont #5	Fine Science Tools	#11254-20	To remove the cornea and extract the lens (Figure 1B)
Tissue-Tek cryomold  (10mm x 10mm x 5mm)	Electron Miscroscopy Sciences	#62534-10	Mold for OCT embedding
Buffers and Reagents	Company	Catalog Number	Comments
Blocking solution			2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in permeabilization buffer.
Gelvatol (anti-fading mounting media)			Under the fume hood, dissolve 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01).  Adjust to pH 8-8.5 with 12N HCl (~ 5 drops).  Store in amber drop bottle at 4°C  (8).
Hoechst 33342 1000x Stock	Thermo Scientific	#62249	1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquot and store in dark, at 4°C for up to 1 year or at -20°C for long term storage. Prepare fresh  at 1 ug/mL (1x)
Isopentane, 99%	GFS Chemicals	#2961
Liquid Nitrogen
Paraformaldehyde (PFA) in PBS	Electron Microscopy Sciences	#15710	Prepared fresh 4% PFA from 16% PFA stock. Store the remaining 16% PFA at 4°C in the dark.
Permeabilization solution			PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3.  Prepare fresh.
Phosphate-buffered saline (PBS)	Bioworld	#41620015-20	0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4.  Prepared from 10x stock
Sucrose solutions	Fisher Scientific	#S-5-500	Dissolve the appropriate amount of sucrose in  37°C PBS (takes ~15 min to dissolve). May be stored for a few days at 4°C.
Tissue-Tek OCT-compound	Sakura	#4583
Antibodies	Company	Catalog Number	Comments
anti-calbindin	Sigma-Aldrich	C8666	To label horinzotal cells
anti-GAD65	Chemicon	AB5082	To label GABAergic amacrine cells
anti-GS	BD Transduction	610517	To label Müller cells
anti-rhodopsin	Millipore	MAB5316	To label rods