Preparação de Cryo-seções retinal do rato para immunohistochemistry

Resumo

Este relatório descreve métodos detalhados para preparar seções congeladas do retina do rato para immunohistochemistry (IHC). Os métodos descritos incluem dissecção do copo posterior ocular, fixação paraformaldeído, incorporação em meios de temperatura de corte ideal (OCT) e orientação tecidual, corte e imunocoloração.

Resumo

A preparação de seções de alta qualidade do olho do rato para immunohistochemistry (IHC) é crítica para avaliar a estrutura e a função retinal e para determinar os mecanismos que subjacentes doenças retinal. Manter a integridade estrutural durante toda a preparação do tecido é vital para obter dados reprodutíveis de IHC retinal mas pode ser desafiante devido à fragilidade e à complexidade da Citoarquitetura retinal. Os fixadores fortes como o formalina de 10% ou a solução de Bouin preservam otimamente a estrutura retinal, impedem frequentemente a análise de IHC realçando a fluorescência do fundo e/ou as interações dediminuição do anticorpo-epítopo, um processo sabido como o mascaramento do epítopo. Os fixatives mais leves, por outro lado, como o paraformaldeído a 4%, reduzem a fluorescência de fundo e o epitope-mascaramento, técnicas de dissecção meticulosa devem ser utilizadas para preservar a estrutura retiniana. Neste artigo, nós apresentamos um método detalhado para preparar copos do posterior da ocular do rato para o IHC que é suficiente preservar a maioria de interações do anticorpo-epítopo sem perda de integridade estrutural retinal. Nós incluímos IHC representativo com os anticorpos aos vários marcadores retinal do tipo da pilha para ilustrar a preservação e a orientação do tecido circunstâncias óptimas e suboptimal. Nosso objetivo é aperfeiçoar estudos de IHC do retina fornecendo um protocolo completo da dissecção do copo do posterior da ocular ao IHC.

Introdução

Immunohistochemistry (IHC) é uma técnica poderosa para localizar proteínas e estruturas celulares específicas nos tecidos in situ^1,2,3. Os métodos inadequados da fixação e o seccionamento secundário-optimal de tecidos complexos podem interromper a estrutura do tecido, gerar a mancha elevada do fundo ou diminuir interações do anticorpo-epítopo, tendo por resultado artefatos de coloração e conseqüente interpretação errónea de Dados IHC⁴. Como a retina de vertebrados é um órgão neural complexo e altamente organizado composto por estratos de fotorreceptores interligados, interneurônios e células ganglionares, é muito frágil e pode ser facilmente interrompido durante a dissecção e o corte. Um protocolo detalhado, padronizado, e validado da dissecção do olho do rato e a orientação à imunomarcação ajudarão significativamente a reduzir artefatos de IHC, desse modo, aumentando a confiabilidade dos resultados e permitindo dados comparativos mais precisos Análise.

Há muitos protocolos para a preparação do tecido para o IHC, entretanto, não todos são apropriados para o tecido retinal. Os fixadores fortes como o formalina de 10% ou a solução de Bouin preservam a estrutura retinal durante a dissecção e o corte⁵. Infelizmente, os fixadores fortes conduzem frequentemente à fluorescência aumentada do fundo e ao mascaramento do epítopo devido à modificação química dos resumos⁶. Por outro lado, os fixadores mais leves, como o paraformaldeído a 4% (PFA) podem aliviar alguns desses artefatos, mas necessitam de dissecção meticulosa e seccionamento para preservar a estrutura retiniana ideal. PFA penetra ràpida o tecido, mas as proteínas Cross-links muito lentamente, reduzindo o risco de mascarar do epítopo. Desde que a incubação do PFA do tempo curto é uma fixação relativamente suave, os tecidos exigem frequentemente o congelamento rápido preservar antígenos. É importante evitar a formação de cristais de gelo durante o congelamento tecidual, pois eles distorcem e danificam a integridade das células e dos tecidos⁷.

Aqui nós descrevemos protocolos detalhados e estandardizados para a dissecção, a fixação, e a Cryo-proteção de copos do posterior da ocular do rato que produzem dados consistentes e de confiança de IHC.

Protocolo

Todos os métodos aqui descritos foram realizados em estrita conformidade com as recomendações do guia nacional de saúde para o cuidado e uso de animais de laboratório fornecidos pelo Instituto de recursos animais de laboratório e foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade da Pensilvânia.

Todas as ferramentas e equipamentos para os métodos são mostrados na Figura 1 e listados na tabela de materiais.

1. Enucleation do olho do rato, dissecção do copo do olho, e incorporação

1. Eutanizar camundongos com dióxido de carbono (CO₂) seguido de decapitação (camundongos pós-natal P0-P11) ou luxação cervical (camundongos adultos > P11). Para os ratos P0-P14, os olhos são cobertos pela pele. Certifique-se de remover a pele antes das etapas subsequentes.
2. Marque a parte temporal do olho (Figura 2a), queimando levemente a córnea usando um cauterizador de cauda. Evite queimar um furo na córnea tocando a córnea muito levemente e para não mais do que uma fração de segundo com o cauterizador.
3. Imediatamente enuclear olhos do rato usando curvo Dumont #5/45 fórceps. Incubar durante 15 min em um tubo de 1,5 ml de criotubo com 1 ml de paraformaldeído de 4% (PFA) em Saline fosfato-tamponado (PBS) no gelo.
4. Após 15 min em 4% PFA, transfira o olho fixo usando o fórceps curvado Dumont #5/45 a um prato modificado da dissecção de 35 milímetros (veja a tabela dos materiais e a Figura 1C) enchido com o PBS e o lugar o microscópio de dissecação.
5. Faça uma pequena incisão na marca de queimadura, perpendicular a e logo acima do limbus (borda da córnea) usando a micro faca.
6. Insira a tesoura curvada na incisão e realize um corte circunferencial da córnea seguindo o limbo (Figura 2b).
7. Retire a córnea e extraia a lente com um fino #5 fórceps de Dumont, (Figura 2b) e levante-o delicadamente afastado da parcela do posterior do olho. O corpo vítreo, o gel desobstruído que enche o espaço entre a lente e o retina, virá para fora com a lente (Figura 2b) e o retina será visível como uma superfície branca que cobre o interior do copo do olho do posterior. Certifique-se de que não há danos visíveis na retina, como furos ou lágrimas (Figura 2C).
8. Lave os copos de olho duas vezes em 1 mL de PBS por 10 min à temperatura ambiente.
9. Cryoprotect os copos do olho equilibrando os em uma solução de sacarose de 15% em PBS durante a noite em 4 ° c até que o copo do olho sumidouros
10. Transfira os copos do olho à sacarose de 30% em PBS para 2-3 h até que o copo do olho sumidouros.
11. Incorporar os copos de olho em OCT em 10 x 10 mm crimológicos (Figura 3a). Usando um microscópio de dissecação, Oriente o olho no cryomold ao longo de seu eixo dorsal-ventral (Figura 2D, Figura 3a) girando o olho até que a marca da queimadura esteja na parte superior, o nervo ótico está na esquerda e a parte cortada do molde enfrenta a direita ( Figura 2D). Tome cuidado para evitar bolhas perto do tecido.
    Nota: para manipular o copo do olho, use uma ponta de prova Titanium feita de um fio Titanium Unido a uma ponta da pipeta.
12. Para fixar-congelar o tecido retiniano, mergulhe o cryomold por pelo menos 5 minutos em um copo do metal que contem o isopentano e coloc a taça no nitrogênio líquido ou no banho seco do etanol do gelo/100% (até 1/3 da altura da Taça do metal).
    Nota: o cryomold deve ser imergido em isopentano para maior que a metade de sua altura, mas não tem que ser completamente submerso.
13. Retire o bloco congelado e enrole-o em folha de alumínio.
14. Conservar a-80 ° c.
15. Marque o bloco congelado usando uma caneta ou Sharpie para registrar a orientação do bloco (Figura 3B).

2. Seccionamento usando um criostat

1. Após ajustar a temperatura do criostato (entre-20 e-25 ° c), permita que os moldes que contêm os copos incorporados do olho equilibrem à temperatura do criostato para 1 h.
2. Instale o bloco com orientação dorso-ventral (Figura 3C) e corte 10 μm de espessura de seções seriais. Coloc com cuidado as seções retinal em corrediças anotadas e numeradas do microscópio.
3. Armazene slides em caixas de slides a-20 ° c ou-80 ° c até os procedimentos do IHC.

3. Imunocoloração por fluorescência utilizando a cremalheira deslizante

Nota: o sistema da cremalheira de corrediça (por exemplo, Sequenza) prende as corrediças do microscópio de vidro com uma placa de tampa, criando um ~ 100 μL de abertura capilar entre a corrediça e a placa.

1. Descongelar as crio-secções à temperatura ambiente (RT) durante 2 h a 4 h para lhes permitir secar e fixar nas lâminas do microscópio.
   Nota: também é possível secá-los a 30-37 ° c durante 30 min a 1 h.
2. Coloc corrediças na cremalheira de corrediça e lave as seções retinal duas vezes em 100-200 μL de PBS por 2 minutos.
3. Permeabilize as secções retinianas incubando-as em 0,25% Triton-X/0, 5% NaN₃em PBS durante 5 min em RT.
4. Adicione 100 μL de solução de bloqueio aos slides.
5. Adicionar 100 μL de anticorpo primário diluído na solução de bloqueio para as lâminas.
6. Incubar secções retinianas durante a noite a 4 ° c.
   Nota: durante este tempo, cubra o rack deslizante para evitar a dessecação das secções.
7. Lave as secções retinianas 3 vezes, cada uma por 15 min, utilizando 200 μL de PBS.
   Nota: a adição de 0, 1-0, 2% Triton-X100 a PBS (PBS-T) permite uma lavagem mais rigorosa, mas pode interromper algumas membranas e estruturas celulares.
8. Incubar seções retinianas em anticorpos secundários com rótulo fluorescente por 1 h em RT. A partir de agora Proteja-se da luz.
9. Lave as secções retinianas 3 vezes, cada uma por 15 min.
10. Incubar as secções retinianas em RT durante 5 min com um marcador nuclear como Hoechst 33342 ou solução DAPI.
11. Lave as secções retinianas 1 vez durante 15 min.
12. Coloque uma lamínula em cima de uma toalha de papel no banco de laboratório.
13. Adicione 2 gotas de suportes de montagem antidesvanecimento ao centro da lamínula.
14. Gire a corrediça sobre para ter a Cryo-seção retinal virada para baixo.
15. Monte com cuidado a lamínula lentamente, em um ângulo de ~ 45 °, derrube o slide na mídia de montagem.
    Nota: evitando formando bolhas como você abaixar o slide no lugar.
16. Aplique pressão mesmo, usando um livro pesado ou catálogo (veja abaixo), para a combinação de deslizamento de cobertura para eliminar o excesso de suportes de montagem.
    Nota: para garantir a consistência na preparação da amostra, sempre use o mesmo objeto, (ou seja, o mesmo livro ou catálogo) para aplicar até mesmo a pressão na lamínula durante a montagem do slide.
17. Mantenha o plano e deixe endurecer durante a noite no RT no escuro. Armazene os slides horizontalmente a 4 ° c indefinidamente.
18. Imagem via microscopia de fluorescência de campo largo ou confocal (Figura 4).

Resultados

Para ilustrar como estes protocolos, asseguram a preservação retinal óptima para IHC, nós sondado seções retinal dos ratos de P28 WT (C57Bl/6N) com os anticorpos ao rodopsina (um marcador do fotorreceptor)⁸, descarboxilase ácido glutâmico 65 (Gad65, uma pilha amacrina marcador)⁹, glutamina sintetase (GS, marcador de célula Müller)¹⁰, e calbindin (marcador de célula horizontal)¹¹ (

Discussão

A dissecção do retina do rato é um processo delicado devido ao tamanho e à forma pequenos de olhos do rato e à fragilidade do tecido retinal. Mesmo que a realização de dissecção de alta qualidade é uma questão de prática, tendo um protocolo detalhado, fornecendo métodos eficientes e dicas é uma necessidade para obter seções retinianas e IHC. Além do que os protocolos descritos aqui, há diversas pontas que permitem as seções retinal de alta qualidade consistentes que são apropriadas para o IHC reprodu...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
6qt. Stainless Steel Beaker (185 x 218mm)	Gilson	#MA-48	For liquid nitrogen (Figure 1E)
Aluminum foil
Cauterizer	Bovie	#AA01	To mark eye orientation (Figure 1A)
Curved forceps, Dumont #5/45 tweezers, 45-degrees bent	Electron Microscopy Sciences	#72703-D	For mouse eye enucleation and maintenance (Figure 1A)
Curved scissors, Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge	Fine Science Tools	#15002-08	To circumferentially cut the cornea (Figure 1B)
Dental wax-coated 35mm dissection dish			For eye cup dissection (Figure 1C)
Dissecting microscope	Leica, Houston, USA	MZ12.5 High-performance stereomicroscope
Micro Knives - Plastic Handle	Fine Science Tools	#10315-12	To make a small incision at the burn mark (Figure 1A)
Pink dental wax	Electron Microscopy Sciences	#72660	For coating dissection dish
Slide Rack and Coverplate	Ted Pella	#36107	For retinal IHC (Figure 1G)
Stainless Steel Beaker (89 x 114mm)	Gilson	#MA-40	For isopentane bath (Figure 1E)
Styrofoam box			For insulated cooler
Thin forceps Dumont #5	Fine Science Tools	#11254-20	To remove the cornea and extract the lens (Figure 1B)
Tissue-Tek cryomold  (10mm x 10mm x 5mm)	Electron Miscroscopy Sciences	#62534-10	Mold for OCT embedding
Buffers and Reagents	Company	Catalog Number	Comments
Blocking solution			2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in permeabilization buffer.
Gelvatol (anti-fading mounting media)			Under the fume hood, dissolve 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01).  Adjust to pH 8-8.5 with 12N HCl (~ 5 drops).  Store in amber drop bottle at 4°C  (8).
Hoechst 33342 1000x Stock	Thermo Scientific	#62249	1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquot and store in dark, at 4°C for up to 1 year or at -20°C for long term storage. Prepare fresh  at 1 ug/mL (1x)
Isopentane, 99%	GFS Chemicals	#2961
Liquid Nitrogen
Paraformaldehyde (PFA) in PBS	Electron Microscopy Sciences	#15710	Prepared fresh 4% PFA from 16% PFA stock. Store the remaining 16% PFA at 4°C in the dark.
Permeabilization solution			PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3.  Prepare fresh.
Phosphate-buffered saline (PBS)	Bioworld	#41620015-20	0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4.  Prepared from 10x stock
Sucrose solutions	Fisher Scientific	#S-5-500	Dissolve the appropriate amount of sucrose in  37°C PBS (takes ~15 min to dissolve). May be stored for a few days at 4°C.
Tissue-Tek OCT-compound	Sakura	#4583
Antibodies	Company	Catalog Number	Comments
anti-calbindin	Sigma-Aldrich	C8666	To label horinzotal cells
anti-GAD65	Chemicon	AB5082	To label GABAergic amacrine cells
anti-GS	BD Transduction	610517	To label Müller cells
anti-rhodopsin	Millipore	MAB5316	To label rods