使用跨女性访问将人类大小的冠状动脉支架植入大鼠腹主动脉

摘要

该协议描述了人类冠状动脉支架植入大鼠的腹部主动脉与^apoE-/- 背景使用跨股骨访问。与其他动物模型相比，穆林模型具有吞吐量高、可重复性高、易处理性和外壳性好等优点，分子标记物广泛可用。

摘要

皮下冠心病干预 （PCI） 结合冠状支架的部署，代表了冠状动脉疾病干预治疗的黄金标准。支架内恢复症 （ISR） 是由支架内新辛蒂莫组织过度增殖决定的，并限制支架的长期成功。各种动物模型被用来阐明支架内复发 （ISR） 背后的病理生理过程，其中猪冠状动脉和兔子胆道模型最常使用。Murine 模型具有吞吐量高、易于处理和外壳、可重复性和分子标记的广泛可用性等优点。非丙蛋白E缺乏^{（apoE-/-）}小鼠模型已广泛用于研究心血管疾病。然而，支架必须小型化才能植入小鼠体内，这涉及到其机械和（潜在）生物特性的重大变化。使用猿^类-/-大鼠可以克服这些缺点，因为apoE-/-大鼠允许评估人类大小的冠状动脉支架，同时提供一个异位表型。这使得它们成为在支架植入后研究 ISR 的极好可靠的模型。在这里，我们详细描述了将市售的人类冠状动脉支架植入具有^apoE-/-背景的老鼠的腹部主动脉，使用跨股骨访问。

引言

皮下冠心病干预（PCI），结合冠状支架的部署，代表了冠状动脉疾病干预治疗的黄金标准^1。然而，支架的长期成功可以限制在支架内复发（ISR）的发生，这是由支架^2，3内新意组织过度增殖决定的。ISR 可能需要用冠状动脉旁路或重新 PCI 进行重新干预。为研究ISR提出了各种动物模型的建议，每个模型都有优点和缺点。最常用的猪冠状动脉和兔肠动脉模型的主要缺点，虽然在支架植入^4、5后出现与人类明显相似的病变，但动物和住房成本高，这带来了后勤困难，特别是在长期研究中，以及处理和设备的限制。此外，猪和兔子细胞蛋白抗体的可用性有限。另一方面，Murine 模型具有吞吐量高、可重复性高、易于操作、外壳等主要优点，因此具有成本效益。此外，有较多的抗体可用。然而，虽然非丙蛋白电子缺乏症^{（apoE-/-）}小鼠已被广泛用于动脉粥样硬化^6，7，8的研究，他们不适合研究ISR，因为支架必须小型化植入小鼠，有可能改变支架的机械特性。此外，小鼠主动脉壁测量在幼鼠50μm和老老鼠⁹中85μm之间，支架必须使用低至2 atm的压力水平进行部署，这可能导致支架¹⁰的不良位。然而，大鼠允许植入市售的人类冠状动脉支架，并表现出类似于主动脉支架植入后较大的动物的血管愈合过程，首先由Langeveld等人¹¹日报道。这项技术最初需要跨腹部通道，这就需要对主动脉进行物理收缩，以实现血液流动的暂时中断。为了避免潜在的相关船只伤害和炎症反应，该技术后来通过引入一个跨组织访问，这进一步导致动物¹²的存活率更高。

由于野生类型大鼠不发展动脉粥样硬化病变13，apoE-/-大鼠已产生使用核酶技术，如转录激活器一样的影响器核糖核酸（TALEN）14，聚类定期间歇短巴林德罗米重复（CRISPR/Cas9）15，和锌手指（ZF）16。自 2011 年以来，ApoE^-/-大鼠已上市。提供外来背景^，apoE-/-大鼠允许更现实地评估人类大小的冠状动脉支架，特别是关于ISR。

在此，我们通过跨性别访问路线描述该方法，并使用市售的薄支柱钴-铬药物脱脂支架 （DES），但是，它也可用于研究其他支架类型，如裸金属支架 （BMS） 或可生物降解支架。

研究方案

这些实验是根据德国动物福利法（TSchG）和2010/63/欧盟关于保护用于科学目的的动物的指令进行的。政府动物护理和使用委员会批准了这项研究的正式批准（第87-51.04.A065号议定书:兰德萨姆特·法尔·纳图尔，乌姆韦尔特·德·弗布劳彻舒茨·诺德海因-韦斯特法伦，德国雷克林豪森）。研究协议符合《实验室动物护理和使用指南》。术后疼痛治疗基于德国实验室动物科学协会 （GV-SOLAS） 的建议以及主动兽医疼痛治疗。

1. 基本技术和常见程序

1. 使用同源猿^-/- 斯普拉格-道利大鼠。使用标准方法¹⁷识别每种动物的基因型。
2. 将动物保持在相同的条件下（21 °C ± 2 °C，60%± 5% 的湿度，以及 12 小时的光/暗循环），并确保免费获得水和食物。
3. 在清洁但非星号条件下执行所有程序。
4. 一旦大鼠麻醉，在手术显微镜下执行所有手术，倍数为16倍。
5. 使用棉签进行压缩溶血。用乳化铃声溶液浸泡的纱布（5 厘米 x 5 厘米）有助于保持腹股沟湿润。
6. 遵守废物处理条例，处理废旧材料。

2. 手术前的准备

1. 在开始操作之前准备兽药。除非另有说明，否则请在室温下保留所有解决方案。
2. 手术前30分钟，皮下施用 0.03-0.05毫克/千克丁丙诺啡。
3. 麻醉大鼠，注射100毫克/千克体重（BW）和8毫克/千克BW西拉辛。
4. 使用称重秤评估大鼠的体重。
5. 将鼠放在加热垫上，用医用胶带固定上下肢。将大鼠的左后肢完全伸展，并尽可能与脊椎保持一致，从而在股动脉和主动脉之间形成一条直线。这将促进气球安装支架通过主动脉分叉前进。
6. 保持麻醉，吸入1.5伏的异氟烷在97.5%的氧气中，流量为2L/min。
   注意:允许大鼠自发呼吸，无需管网。
7. 应用眼药膏，防止无意识时眼睛损伤。
8. 从大鼠腹股沟和下腹部区域剃毛，用波维酮碘溶液对相应的皮肤进行消毒。
9. 在开始手术之前，通过捏紧尾尖和分形组织来验证麻醉的深度。

3. 手术

1. 在左腹股沟中切开约 0.5+u20121 厘米，以打开皮肤和底层筋膜。
2. 在深部进行模糊解剖和探查，直到可以识别脉动的左股动脉。
3. 使用非常精细的钳子，通过轻轻取出周围的结缔组织来准备股骨动脉。小心伤害股骨神经和股骨静脉，这是动脉中间。
4. 准备大约1厘米的股骨动脉。小心地将钳尖放在容器下，轻轻抬起。
5. 线条4-0丝缝合线下动脉的解剖和接近部分，并形成吊索。夹住手术夹的分支之间的两根螺纹吊索的末端。使用手术夹控制动脉。轻轻伸展和抬起吊索，以暂时中断血液流动。
   注意:快速工作，以避免可能导致组织损伤的长时间旅游。
6. 使用锋利的微剪刀，在股动脉中间进行动脉切除术。
7. 通过动脉切除术引入导线。当到达近线吊索时，通过移动手术夹释放螺纹的张力，并将导线进一步向腹部主动脉推进。
   注意:使用切割机切割导线以便于操作。
8. 将导线的近端放置在隔膜和肾动脉之间。
   注意:将导线推进太远会承受主动脉或心脏损伤的风险。我们建议打开腹部，以确保引导线和支架的充分定位，至少对于前几只动物。
9. 在导引线上引入一个压接式和气球式冠状动脉支架，尺寸为 2.25 mm x 8 mm（最大 2.5 mm x 8 mm），并将其推进到腹动脉。
10. 将支架放在主动脉分叉上方，但放在肾动脉下方。使用充气注射器系统将气球导管充气至 12 atm 15s，从而部署支架。
11. 根据制造商对使用支架的建议，放气气球导管并保持负压。
12. 在将支架留在原位时，慢慢取出放气导管。
13. 在取出导管之前，用手术夹在切口上方的螺纹环上制造张力，再次中断血液流动。然后取出气球导管，直接将容器靠近。
14. 将近部和解剖线环系成石灰，以盖住股动脉，并确认动脉切除术的充分血吸虫。辅助动脉将确保进一步灌注到肢体。
15. 使用 10-0 非可恢复缝合，关闭动脉的肌肉以及皮肤切口。

4. 支架植入后的动物护理

1. 手术后，让老鼠在特殊的重症监护室笼子里恢复60分钟，笼子里有温暖的空气（30\u201235°C）和氧气供应。
2. 仔细观察动物，直到完全康复。之后，将老鼠移入普通笼子。提供获得水和食物的辅助通道。
3. 根据临床评估，每6-12小时服用一次术后镇痛，服用0.03-0.05毫克/千克丁丙诺啡（s.c.，500μl NaCl），共72小时。
4. 将食物与氯皮多格雷（15毫克/千克）混合，以避免植入支架的血栓形成。
5. 为了改善高血糖条件和斑块形成，在出生后6\u20128周开始西方饮食喂养，一直持续到安乐死。如果需要，一群喂养正常老鼠的动物可以作为控制。

5. 组织收集和处理

1. 在指定时间点开始组织去除之前，根据 IACUC 指南对动物实施安乐死。在观察期结束时收获被强化的主动脉进行病理分析。
2. 通过中线切口打开腹部，取出主动脉的固定部分以及主动脉的相邻非固定部分，每个部分尺寸为 0.5 厘米。
3. 将组织放入 4% 缓冲形式素的溶液中，以进行 24 小时的固定。
4. 将被强化的动脉组织嵌入塑料中，并按照标准协议^18、19进行组织学和免疫化学染色。

6. 组织学分析

1. 通过与计算机相连的显微镜，使用适当的图像分析软件，对紧固主动脉的近、中、离部分的顺序部分进行成形分析。
2. 使用图形绘图板跟踪外部弹性拉米纳（EEL，在冒险和介质之间）、内部弹性拉米纳（IEL、介质和新因蒂玛之间）和流明的轮廓。从这些值中，使用软件计算 EEL 区域、IEL 区域和流明区域。
3. 计算支架内复发 （ISR） 的横截面面积百分比:
   
4. 计算新近面积（A_i）:
   
5. 测量每个支架支柱上的新意厚度 （NIT），作为支柱和流明之间的距离。测量支架支柱之间的NIT，作为 IEL 和流明之间的距离。
   注:或者，将NIT计算为
   
   其中P_L和P_IEL是流明和内部弹性拉米纳周长，分别为^20。
6. 根据研究的要求进行额外的分析。

结果

该协议描述了使用跨股骨通道（图1）植入大鼠腹部主动脉的支架。这种动物模型的第一个中心点是，它允许部署人类大小的冠状动脉支架。一个市售的压接和气球安装冠状动脉支架可以放置到大鼠的腹部主动脉。因此，还可以应用与人类相同的支架部署原则。使用大鼠的另一个优点是提供转基因菌株，如^apoE-/- 大鼠，这些菌株在商业上是可用的。

讨论

本协议描述了将人类大小的冠状动脉支架植入^大鼠腹 主动脉。几个技术点值得强调。首先，应避免支架大小和主动脉大小之间的不匹配。放置过小的支架会导致支架失调，而植入对主动脉来说太大的支架则会导致血管过度拉伸、撕裂和损伤。因此，我们建议使用直径在 2.0 到 2.5 毫米之间的支架，并将植入压力保持在建议范围内，而不要过度拉伸支架。最合适的植入压力通常由支架制造商...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Diet
SNIFF High Fat diet + Clopidogrel (15 mg/kg)	SNIFF Spezialdiäten GmbH, Soest	custom prepared	Western Diet
Drugs and Anesthetics
Buprenorphine	Essex Pharma	997.00.00
ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser	Eickemeyer	4802885
Isoflurane	Forene Abbott	B 506
Isotonic (0.9%) NaCl solution	DeltaSelect GmbH	PZN 00765145
Ringer's lactate solution	Baxter Deutschland GmbH	3775380
(S)-ketamine	CEVA Germany
Xylazine	Medistar Germany
Consumable supplies
10 mL syringes	BD Plastipak	4606108V
2 mL syringes	BD Plastipak	4606027V
6-0 prolene suture	ETHICON	N-2719K
4-0 silk suture	Seraflex	IC 158000
Bepanthen Eye and Nose Ointment	Bayer Vital GmbH	6029009.00.00
Cotton Gauze swabs	Fuhrmann GmbH	32014
Durapore silk tape	3M	1538-1
Poly-Alcohol Skin Desinfection Solution	Antiseptica GmbH	72PAH200
Sterican needle 18 G	B. Braun	304622
Sterican needle 27 3/4 G	B.Braun	4657705
Tissue Paper	commercially available
Surgical instruments
Graefe forceps curved x1	Fine Science Tools Inc.	11151-10
Graefe forceps straight	Fine Science Tools Inc.	11050-10
Needle holder Mathieu	Fine Science Tools Inc.	12010-14
Scissors	Fine Science Tools Inc.	14074-11
Semken forceps	Fine Science Tools Inc.	11008-13
Small surgical scissors curved	Fine Science Tools Inc.	14029-10
Small surgical scissors straight	Fine Science Tools Inc.	14028-10
Standard pattern forceps	Fine Science Tools Inc.	11000-12
Vannas spring scissors	Fine Science Tools Inc.	15000-08
Equipment
Dissecting microscope	Leica MZ9
Temperature controlled heating pad	Sygonix	26857617
Equipment for stent implantation
Drug-eluting stent Xience 2,25mm x 8mm	Abbott Vascular USA	1009544-18
Guide wire Fielder XT PTCA guide wire: 0.014" x 300cm	ASAHI INTECC CO., LTD Japan	AGP140302
Inflation syringe system	Abbott 20/30 Priority Pack	1000186
Tissue processing and analysis
30% H2O2	Roth	9681	Histology
Ethanol	Roth	K928.1	Histology
Giemsas Azur-Eosin-Methylenblau	Merck	109204	Histology
Graphic Drawing Tablet	WACOM Europe GmbH	CTL-6100WLK-S
Roti Histofix, Formaldehyd 4% buffered	Roth	P087	Histology
Technovit 9100	Morphisto	12225.K1000	Histology