Implantação de stents coronários de tamanho humano na aorta abdominal de rato usando um acesso trans-femoral

Resumo

Este protocolo descreve a implantação de stents coronários humanos na aorta abdominal de ratos com um apoE^-/- fundo usando um acesso trans-femoral. Em comparação com outros modelos animais, os modelos murinos carregam as vantagens da alta produtividade, reprodutibilidade, facilidade de manuseio e habitação, e uma ampla disponibilidade de marcadores moleculares.

Resumo

A intervenção coronária percutânea (ICI), combinada com a implantação de um stent coronário, representa o padrão-ouro no tratamento intervencionista da doença arterial coronariana. A restenose in-stent (ISR) é determinada por uma proliferação excessiva do tecido neointimal dentro do stent e limita o sucesso a longo prazo dos stents. Uma variedade de modelos animais têm sido usados para elucidar processos fisiopatológicos subjacentes à restenose de stent (ISR), sendo o coronário suíno e os modelos de artéria ilíaca de coelho sendo os mais utilizados. Os modelos murinos oferecem as vantagens de alta produtividade, facilidade de manuseio e habitação, reprodutibilidade e ampla disponibilidade de marcadores moleculares. O modelo de camundongos deficientes apolipoprotein E (apoE^-/- ) tem sido amplamente utilizado para estudar doenças cardiovasculares. No entanto, os stents devem ser miniaturizados para serem implantados em camundongos, envolvendo mudanças importantes de suas propriedades mecânicas e (potencialmente) biológicas. O uso de apoE^-/- ratos podem superar essas deficiências como apoE^-/- ratos permitem a avaliação de stents coronários de tamanho humano e, ao mesmo tempo, fornecendo um fenótipo aterogênico. Isso faz deles um modelo excelente e confiável para investigar isr após a implantação do stent. Aqui, descrevemos, em detalhes, a implantação de stents coronários humanos comercialmente disponíveis na aorta abdominal de ratos com um apoE^-/- fundo usando um acesso trans-femoral.

Introdução

A intervenção coronária percutânea (ICI), combinada com a implantação de um stent coronário, representa o padrão-ouro no tratamento intervencionista da doença arterial coronariana¹. O sucesso a longo prazo dos stents, no entanto, pode ser limitado pela ocorrência de restenose in-stent (ISR) que é determinada por uma proliferação excessiva de tecido neointimal dentro do stent^2,3. O ISR pode exigir uma nova intervenção com bypass da artéria coronária ou re-PCI. Uma variedade de modelos animais foram sugeridos para o estudo do ISR, cada um deles apresentando vantagens e deficiências. As principais desvantagens dos modelos de artérias ilíacas suínos mais utilizados e coelhinhos, embora desenvolvendo lesões marcadamente semelhantes aos humanos após a implantação do stent^4,5, são grandes custos de animais e habitação que trazem dificuldades logísticas especialmente em estudos de longo prazo, bem como limitações no manuseio e equipamentos. Além disso, a disponibilidade de anticorpos para proteínas celulares de suínos e coelhos é limitada. Por outro lado, os modelos murine proporcionam as principais vantagens do alto rendimento e reprodutibilidade, bem como a facilidade de manuseio, moradia e, portanto, custo-efetividade. Além disso, um maior número de anticorpos estão disponíveis. No entanto, enquanto os camundongos deficientes e-deficientes de apolipoproteína (apoE^-/-) camundongos têm sido amplamente utilizados para o estudo da aterosclerose^6,7,8, eles são inadequados para o estudo do ISR, pois os stents devem ser miniaturizados para serem implantados em camundongos, potencialmente mudando as propriedades mecânicas dos stents. Além disso, a parede aórtica de camundongos mede entre 50 μm em camundongos jovens e 85 μm em camundongos antigos⁹, e os stents devem ser implantados usando níveis de pressão tão baixos quanto 2 atm, o que pode levar à malapposição do stent¹⁰. Os ratos, no entanto, permitem a implantação de stents coronários humanos disponíveis comercialmente, e demonstram um curso de cura vascular semelhante a animais maiores após a implantação do stent aórtico, relatado pela primeira vez por Langeveld et al.¹¹. Esta técnica originalmente exigia um acesso trans-abdominal, o que exigia uma constrição física da aorta para conseguir uma interrupção temporária do fluxo sanguíneo. Para evitar a lesão potencialmente associada do vaso e reações inflamatórias, a técnica foi posteriormente refinada pela introdução de um acesso transilílico, o que resultou, além disso, em uma maior taxa de sobrevivência dos animais¹².

Como ratos de tipo selvagem não desenvolvem lesões ateroscleróticas¹³, apoE^-/- ratos foram gerados usando técnicas de nuclease como Transcription Activator-Like Effector Nuclease (TALEN)¹⁴, Clustered Regularmente Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR/Cas9)¹⁵, e Zinc Finger (ZF)¹⁶. ApoE^-/- ratos estão disponíveis comercialmente desde 2011. Fornecendo um fundo atherogênico, os ratos apoE^permitem uma avaliação mais realista dos stents coronários do tamanho humano, especialmente no que diz respeito ao ISR.

Aqui, descrevemos o método através da rota de acesso transfemoral e usando um stent de eluição de drogas de cobalto-cromo (DES) comercialmente disponível, no entanto, também pode ser aplicado para o estudo de outros tipos de stent, como stents metálicos nus (BMS) ou stents biodegradáveis.

Protocolo

Os experimentos foram realizados de acordo com a Lei Alemã de Bem-Estar Animal (TSchG) e a Diretiva 2010/63/UE relativas à proteção de animais utilizados para fins científicos. A aprovação oficial deste estudo foi concedida pelo Comitê Governamental de Cuidados e Uso de Animais (Protocolo nº: AZ 87-51.04.2010.A065; Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Recklinghausen, Alemanha). O protocolo de estudo cumpriu o Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. O tratamento da dor pós-operatória baseia-se nas recomendações da Sociedade Alemã de Ciência Animal Laboratorial (GV-SOLAS), bem como da Terapia Veterinária da Dor.

1. Técnicas básicas e procedimentos comuns

1. Use ratos homozigosos^{apoE -/-} Ratos Sprague-Dawley. Identificar o genótipo de cada animal usando os métodos padrão¹⁷.
2. Mantenha os animais em condições idênticas (21 °C ± 2 °C, 60% ± 5% de umidade e um ciclo claro/escuro de 12 horas) e garanta o livre acesso à água e aos alimentos.
3. Realizar todos os procedimentos em condições limpas, mas não estésteres.
4. Uma vez que o rato é anestesiado, realize todos os procedimentos sob um microscópio cirúrgico em uma ampliação de 16x.
5. Use cotonetes de algodão para hemostasia de compressão. Os cotonetes de gaze (5 cm x 5 cm) encharcados com solução de Ringer lactado são úteis para manter a virilha úmida.
6. Siga as normas de descarte de resíduos para descartar materiais usados.

2. Preparações antes da cirurgia

1. Prepare as drogas veterinárias antes de começar a operação. Mantenha todas as soluções em temperatura ambiente, a menos que seja indicado de outra forma.
2. Trinta minutos antes do procedimento, administre 0,03-0,05 mg/kg buprenorfina subcutânea.
3. Anestesiar o rato com uma injeção intraperitoneal de 100 mg/kg de peso corporal (BW) (S)-cetamina e 8 mg/kg de xilazina BW.
4. Avalie o peso do rato usando uma balança de pesagem.
5. Coloque o rato em uma almofada de aquecimento e fixe os membros superiores e inferiores usando fita médica. Posicione o rato com seu membro traseiro esquerdo totalmente estendido e o máximo possível de linha com sua coluna vertebral, de modo a criar uma linha reta entre artéria femoral e aorta. Isso facilitará o avanço do stent montado em balão através da bifurcação aórtica.
6. Manter anestesia com inalação de 1,5 vol% de isoflurane em 97,5% de oxigênio a uma vazão de 2 L/min.
   NOTA: Deixe o rato respirar espontaneamente, sem entubação.
7. Aplique pomada ocular para evitar danos oculares durante a inconsciência.
8. Raspe a pele da virilha e da área inferior do abdômen do rato e esterilize a pele correspondente com uma solução povidone-iodo.
9. Antes de iniciar a cirurgia, verifique a profundidade adequada da anestesia beliscando a ponta da cauda e o tecido interdigital.

3. Cirurgia

1. Faça uma incisão medial de ~0,5\u20121 cm na virilha esquerda para abrir a pele e a fáscia subjacente.
2. Dissecar e sondar sem rodeios nas profundezas até que a artéria femoral esquerda pulsante possa ser identificada.
3. Usando fórceps muito finos, prepare a artéria femoral removendo suavemente o tecido conjuntivo circundante. Tenha cuidado para danificar nem o nervo femoral nem a veia femoral, que é medial para a artéria.
4. Prepare cerca de 1 cm da artéria femoral. Coloque cuidadosamente a ponta dos fórceps sob o vaso para levantá-la suavemente.
5. Roscas de sutura de seda 4-0 sob as partes distal e proximal da artéria e formam slings. Aperte as extremidades de cada um dos dois estilado entre os ramos de um grampo cirúrgico. Use os grampos cirúrgicos para controlar a artéria. Estique suavemente e levante os estilados para interromper temporariamente o fluxo sanguíneo.
   NOTA: Trabalhe rápido para evitar um torniquete prolongado que possa levar a danos teciduais.
6. Usando micro tesoura afiada, realize uma arteriotomia no meio da artéria femoral.
7. Introduza um fio guia através da arteriotomia. Ao atingir o sling do fio proximal, solte a tensão da rosca movendo o grampo cirúrgico e avance o fio-guia mais para a aorta abdominal.
   NOTA: Corte o fio guia usando um cortador de arame para facilitar o manuseio.
8. Coloque a extremidade proximal do fio guia entre o diafragma e as artérias renais.
   NOTA: O avanço do fio-guia é muito longe, traz o risco de lesão aórtica ou cardíaca. Recomendamos abrir o abdômen para garantir o posicionamento adequado do fio guia e do stent pelo menos para os primeiros vários animais.
9. Introduza um stent coronário crimped e montado em balão medindo 2,25 mm x 8 mm (máx. 2,5 mm x 8 mm) sobre o fio guia na artéria femoral e avance-o para a aorta abdominal.
10. Coloque o stent logo acima da bifurcação aórtica, mas abaixo das artérias renais. Implante o stent inflando o cateter de balão para 12 atm por 15 s usando um sistema de seringa inflacionária.
11. Esvazie o cateter de balão e mantenha pressão negativa de acordo com as recomendações do fabricante para o stent em uso.
12. Retire lentamente o cateter deflacionado enquanto deixa o stent no lugar.
13. Pouco antes de retirar o cateter, crie tensão na alça da rosca acima da incisão com o grampo cirúrgico para interromper novamente o fluxo sanguíneo. Em seguida, remova o cateter do balão e liga diretamente o vaso proximally.
14. Amarre os laços proximais e os fios distais para ligar a artéria femoral e confirmar hemostasia adequada da arteriotomia. As artérias colaterais garantirão mais perfusão ao membro.
15. Feche o músculo sobrepondo a artéria, bem como a incisão da pele usando suturas não resorbáveis de 10-0.

4. Cuidados com animais após implantação de stent

1. Imediatamente após a operação, permita que o rato se recupere por 60 minutos em uma gaiola de unidade de terapia intensiva especial com ar aquecido (30\u201235 °C) e um suprimento de oxigênio.
2. Observe os animais cuidadosamente até que esteja totalmente recuperado. Depois, mova os ratos para uma gaiola normal. Fornecer acesso a ad libitum à água e à comida.
3. Administrar a analgesia pós-operatória a cada 6-12 horas com 0,03-0,05 mg/kg buprenorfina (s.c., em 500μl NaCl) para um total de 72 horas sob avaliação clínica.
4. Tenha o alimento misturado com clopidogrel (15 mg/kg) para evitar trombose do stent implantado.
5. Para melhorar as condições hipercolesterolômicas e a formação de placas, inicie a alimentação dietética ocidental em 6\u20128 semanas após o nascimento e continue até a eutanásia. Se desejar, uma coorte de animais alimentados com comida normal de ratos pode servir de controle.

5. Coleta e processamento de tecidos

1. Antes de iniciar a explantação do tecido no ponto de tempo designado, eutanize o animal de acordo com as diretrizes da IACUC. Colher a aorta stented para análise histológica no final do período de observação.
2. Abra o abdômen por uma incisão midline e remova o segmento stent da aorta, bem como partes não-stentadas adjacentes da aorta, medindo 0,5 cm cada.
3. Coloque o tecido em uma solução de formalina tamponada de 4% por 24 horas para fixação.
4. Incorporar o tecido arterial stent em plástico e realizar coloração histológica e imunohistoquímica de acordo com os protocolos padrão^18,19.

6. Análise histomorfométrica

1. Realize a análise histomorfométrica de seções sequenciais da parte proximal, média e distal da aorta stented por meio de um microscópio ligado a um computador com um software de análise de imagem apropriado.
2. Traçar os contornos da lâmina elástica externa (EEL, entre adventitia e mídia), lamina elástica interna (IEL, entre mídia e neointima), e lúmen com um tablet gráfico de desenho. A partir desses valores, calcule a área de EEL, área de IEL e área de lúmen com o software.
3. Calcular a porcentagem de reenose de área transversal no stent (ISR):
   
4. Calcular a área neointimal total (A_i):
   
5. Meça a espessura neointimal (NIT) sobre cada suporte de stent como a distância entre strut e lúmen. Meça o NIT entre os suportes de stent como a distância entre IEL e lúmen.
   NOTA: Alternativamente, calcule o NIT como
   
   onde P_L e P_IEL são o lúmen e perímetro interno elástico de lamina,^{respectivamente 20}.
6. Realizar análises adicionais de acordo com os requisitos do estudo.

Resultados

Este protocolo descreve a implantação de stent na aorta abdominal de ratos utilizando uma rota de acesso trans-femoral(Figura 1). O primeiro ponto central deste modelo animal é que ele permite a implantação de stents coronários de tamanho humano. Um stent coronário comercialmente disponível e montado em balão pode ser colocado na aorta abdominal de ratos. Assim, além disso, o mesmo princípio de implantação de stent como em humanos pode ser aplicado. Outra vantagem do uso de rato...

Discussão

Este protocolo descreve a implantação de stents coronários de tamanho humano na aorta abdominal de apoE^-/- ratos. Vários pontos técnicos merecem ser enfatizados. Primeiro, deve ser evitada uma incompatibilidade entre o tamanho do stent e o tamanho da aorta. Colocar um stent muito pequeno pode levar à malapa do stent, enquanto a implantação de um stent muito grande para a aorta pode causar excesso de alongamento, rasgos e ferimentos do vaso. Por isso, recomendamos o uso de stents entre 2,0 e 2,5 mm de d...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Diet
SNIFF High Fat diet + Clopidogrel (15 mg/kg)	SNIFF Spezialdiäten GmbH, Soest	custom prepared	Western Diet
Drugs and Anesthetics
Buprenorphine	Essex Pharma	997.00.00
ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser	Eickemeyer	4802885
Isoflurane	Forene Abbott	B 506
Isotonic (0.9%) NaCl solution	DeltaSelect GmbH	PZN 00765145
Ringer's lactate solution	Baxter Deutschland GmbH	3775380
(S)-ketamine	CEVA Germany
Xylazine	Medistar Germany
Consumable supplies
10 mL syringes	BD Plastipak	4606108V
2 mL syringes	BD Plastipak	4606027V
6-0 prolene suture	ETHICON	N-2719K
4-0 silk suture	Seraflex	IC 158000
Bepanthen Eye and Nose Ointment	Bayer Vital GmbH	6029009.00.00
Cotton Gauze swabs	Fuhrmann GmbH	32014
Durapore silk tape	3M	1538-1
Poly-Alcohol Skin Desinfection Solution	Antiseptica GmbH	72PAH200
Sterican needle 18 G	B. Braun	304622
Sterican needle 27 3/4 G	B.Braun	4657705
Tissue Paper	commercially available
Surgical instruments
Graefe forceps curved x1	Fine Science Tools Inc.	11151-10
Graefe forceps straight	Fine Science Tools Inc.	11050-10
Needle holder Mathieu	Fine Science Tools Inc.	12010-14
Scissors	Fine Science Tools Inc.	14074-11
Semken forceps	Fine Science Tools Inc.	11008-13
Small surgical scissors curved	Fine Science Tools Inc.	14029-10
Small surgical scissors straight	Fine Science Tools Inc.	14028-10
Standard pattern forceps	Fine Science Tools Inc.	11000-12
Vannas spring scissors	Fine Science Tools Inc.	15000-08
Equipment
Dissecting microscope	Leica MZ9
Temperature controlled heating pad	Sygonix	26857617
Equipment for stent implantation
Drug-eluting stent Xience 2,25mm x 8mm	Abbott Vascular USA	1009544-18
Guide wire Fielder XT PTCA guide wire: 0.014" x 300cm	ASAHI INTECC CO., LTD Japan	AGP140302
Inflation syringe system	Abbott 20/30 Priority Pack	1000186
Tissue processing and analysis
30% H2O2	Roth	9681	Histology
Ethanol	Roth	K928.1	Histology
Giemsas Azur-Eosin-Methylenblau	Merck	109204	Histology
Graphic Drawing Tablet	WACOM Europe GmbH	CTL-6100WLK-S
Roti Histofix, Formaldehyd 4% buffered	Roth	P087	Histology
Technovit 9100	Morphisto	12225.K1000	Histology