新型人类组织特征视网膜培养技术的特征

摘要

这项研究旨在开发一种新的人体组织性视网膜培养（HORC）模型，防止在外植过程中损害视网膜的完整性。这是通过培养视网膜与过度的四肢和底层视网膜色素上皮-胆碱（RPE-胆碱）和硬膜。

摘要

以前的人类组织状视网膜培养（HORC）模型已经利用了分离视网膜:然而，如果没有视网膜色素上皮-胆碱（RPE-胆碱）和硬化物的结构支持，脆弱的视网膜的完整性很容易受到损害。这项研究的目的是开发一个新的HORC模型，其中含有视网膜，RPE胆碱和硬膜，以保持视网膜的完整性，当培养视网膜外植。

沿着豪华巴士进行割礼以去除虹膜和透镜后，制作了四个深切口来平整眼罩。与以前的 HORC 协议不同，不仅用于切开视网膜，还用于切开 RPE 胆碱和硬化物。由此产生的三层外植培养为72小时。血氧林和Eosin染色（H&E）用于评估解剖结构，视网膜外植进一步的特点是免疫造血化学（IHC）的凋亡，穆勒细胞完整性和视网膜炎症。为了确认疾病诱导的可能性，外生植物暴露于高血糖（HG）和促炎细胞因子（Cyt），以模仿糖尿病视网膜病变（DR）。Luminex 磁珠检测用于测量释放到培养介质中的 DR 相关细胞因子。

H&E染色揭示了视网膜拉梅拉和紧凑的细胞核在视网膜外植与底层RPE-胆碱和硬化，而视网膜没有基础结构表现出减少厚度和严重的核损失。IHC结果显示，没有凋亡和视网膜炎症，以及保存的穆勒细胞完整性。Luminex 检测显示，与 24 小时的基线水平相比，暴露在 HG 和 Cyt 的视网膜外植体中与 DR 相关的亲炎细胞因子的分泌显著增加。

我们成功地开发并定性了一种新的HORC协议，其中视网膜完整性被保留，没有凋亡或视网膜炎症。此外，当视网膜外植物暴露在HG + Cyt中时，DR相关亲炎症生物标志物的诱导分泌表明，该模型可用于临床可翻译视网膜疾病研究。

引言

视网膜是一种高度专业化的眼部结构，负责将传入的光能转化为电信号，然后由大脑处理，以进行视觉感知。人类视网膜包含一系列动态的细胞类型，高度组织在一个独特的拉梅拉结构，包括两个突触和三个核层^1（图1）。视网膜平衡是由神经视网膜细胞、血管、神经、结缔组织和RPE¹之间的复杂连接维持的。由于复杂的视网膜解剖学和生理学，许多视网膜疾病的机制仍然缺乏了解^{2，3，4，5。}为了更好地研究视网膜疾病，已经开发了^{6，7，8，9}的HORC模型。与动物研究和体外培养相比，HORC模型具有优势，因为它们保留了动态细胞环境和复杂的神经血管相互作用，为临床翻译提供了良好的模型。

图1:人眼的后眼结构。前后视网膜层为:神经纤维层（NFL）、结节细胞层（GCL）、内丛状层（IPL）、内核层（INL）、外丛状层（OPL）、外核层（ONL）、光受体内段（IS）和光受体外层（OS）。视网膜内的细胞包括结节细胞（蓝色）、阿马林细胞（黄色）、双极细胞（红色）、水平细胞（紫色）、棒光受体（粉红色）和锥体光受体（绿色）。视网膜位于前。RPE，布鲁奇的膜，胆囊和硬膜位于视网膜的后。请注意，显示的图像只是视网膜的示意图，每个层内细胞/视网膜连接的比例可能不表示体内设置。请单击此处查看此图的较大版本。

先前的荷尔克协议6，7，8，9涉及使用手术颤音将视网膜从底层RPE-胆碱和硬化物中分离出来。然而，如果没有这些基础结构的支持，半透明视网膜变得脆弱，难以处理，诸如钳子等工具很容易破坏其完整性。此外，在没有RPE的情况下分离视网膜已证明会导致结核细胞凋亡和光受体退化^{10，11，12。}因此，一个替代的HORC协议，尽量减少视网膜完整性的损失，并更好地模仿体内环境将是有用的。这在研究视网膜疾病机制时尤其重要，因为外植过程中的身体损伤可能会引入人工制品。因此，本研究的目的是开发一种新的HORC模型，其中包括RPE-巧克力和硬皮，以保护视网膜的完整性，在外植物处理和文化。

为了实现这一目标，在残余的病毒和底层的RPE-胆囊和硬化物之间"夹"出视网膜外植物。在三明治外植物中，视网膜压低，以防止视网膜分离和折叠，而坚韧、纤维状硬化的硬化物既充当结构支撑的脚手架，又充当钳子的接触点。此外，动物模型已经表明，在培养中保留RPE可以防止视网膜退化和胶质增殖，这是穆勒细胞对缺氧和炎症等危险信号的反应，10，11，12。

为了描述模型的特点，三明治视网膜外植物被染色了血氧林和Eosin（H&E），以评估解剖结构和免疫造血化学（IHC）的进行， 标记外生植物与终端脱氧核苷酸转移酶dUTP尼克结束标签（TUNEL，凋亡细胞标记），胶质纤维酸性蛋白（GFAP，视网膜炎症和穆勒细胞激活标记），和维他命，穆勒细胞完整性的标志。为了确定该模型是否可以诱导形成分子疾病迹象， 这些外生植物暴露在高血糖（HG）与亲炎细胞因子（Cyt），白细胞素介素-1+（IL-1+）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α），一种培养环境，已被证明模仿糖尿病视网膜病变（DR）在细胞和动物疾病模型13，14，15。在DR模型中使用了Luminex检测来测量释放到培养基中的细胞因子。

研究方案

人体捐赠眼杯是在角膜切除后从新西兰国家眼库获得的，并经北B健康和残疾伦理委员会（NTX/06/19/CPD/AM07）批准。

注:该培养物应在 II 类生物安全柜中进行，以确保无菌组织培养条件。组织必须在24小时验尸后培养，以避免严重的视网膜完整性损失。

图2:显示收集三明治视网膜外植程序的图片。对于外植制剂，使用一个锋利的尖端和一个钝端的解剖剪刀，钝端面向地球内部，以减少切口过程中的组织损伤。还要使用带钝端的钳子，以避免在处理过程中划伤眼内组织。使用手术剪刀，钝端朝内，沿着豪华巴士切割，以去除虹膜和镜头（A-C）。如果直接观察打开的眼罩（D），则可以找到 ONH。使用带有钝尖的钳子，握住硬囊以稳定地球（E）。通过向 ONH 进行两个深切口，将地球垂直分成两半，但不会穿过 ONH。沿着水平子午线（G）重复上述步骤。在硬囊上涂抹钝钳，轻轻地将地球打开到三叶草形状（H-K）。使用钳子小心地操纵视网膜，以平滑折叠的视网膜，作为视网膜拖拉到视网膜上，但不要直接触摸视网膜（I）。如果导致视网膜分离或折叠（图2中未显示透明四肢未在照片上拍摄良好），则将其移除）。定位视网膜平坦的区域，使用手术颤栗（L）提取视网膜外植物。在硬囊中施用钳子，小心地将视网膜外植物转移到预先准备的培养介质（M，N）中。由于重量的原因，整个三明治外植物应该沉入井底，因此每个外植物都浸入中等（O）中。请单击此处查看此图的较大版本。

1. 从眼杯中提取三明治视网膜外植物

1. 取出虹膜和镜头。
   1. 将眼杯放在培养皿内，虹膜和镜头朝上，视神经头（ONH）接触培养皿（图2A）。
   2. 用钳子将眼杯稳定地握在利姆布斯（图2B）。
   3. 沿着小巴的外缘（图2A）进行小切口，分离虹膜和透镜。
   4. 小心地取出虹膜和镜头。避免在操作过程中干扰视网膜（图2C）。
      注:镜头不会落入眼杯，因为它通过佐纳纤维连接到辅助身体。
2. 把眼杯压扁。
   1. 眼杯仍然直立坐着，识别 ONH 。这更容易与明亮的白色光源（图2D）。
   2. 在四个象限向 ONH （图2E） 。培养皿可以旋转，以便于处理。 不要 切断 ONH。
   3. 小心地将眼杯展开并压扁（图2E）。
   4. 将钳子涂在硬膜上，而不是视网膜上，以避免破坏视网膜的完整性。
      注:外周视网膜分离和折叠是不可避免的，因为溢出的四肢的重量将拉到视网膜上。在这些区域，去除视网膜以防止进一步视网膜折叠。记得留下残余的静脉，以稳定视网膜在RPE胆囊和硬化物的顶部。
3. 收集三明治视网膜外植。
   1. 在没有视网膜褶皱的区域，在视网膜上放置手术颤音（图2F）。
   2. 用力压击以穿透硬膜，这会产生裂开的声音。
   3. 将肌酸扭曲 180°，以确保硬化层已完全穿透，使视网膜外植现在从剩余的组织中分离出来。
   4. 将钳子涂抹在硬囊中，将三明治视网膜除植物转移到培养介质（图2G-I）。
   5. 从每个象限的外周视网膜获得2-3个三明治视网膜外植物。
      注:三明治视网膜外植有时可能被困在三叶虫的开口。使用钳子，轻轻地挑出硬盘底部的一小部分。当刀片钝化并可能导致视网膜损失时，这种情况会更频繁发生（图 3A-C）。
   6. 切出 1-2 种视网膜除植物后使用新的肌肽，因为刀片很容易变钝 （图 3C）
      图3:故障排除。在提取过程中，视网膜外植可能被困在手术的开口（A）。轻轻地从硬皮纸底部调出组织，而不接触视网膜（B）。如果手术肌肽用于提取两种以上的视网膜外植，这种情况会更频繁发生，因为刀片很容易变钝（C）。请单击此处查看此图的较大版本。
4. 培养视网膜外植。
   1. 准备含有杜尔贝科改良鹰中等营养混合物F-12（DMEM-F12）和1倍抗生素和抗菌剂混合物（AA，100x库存）的文化介质。
   2. 在外植提取之前，将 500 μL 的介质放在 24 井板的井中，并在孵化器中平滑。这很重要，因为添加介质后可以脱落视网膜。
   3. 培养三明治视网膜除植物在37°C高达72小时在潮湿的5%CO₂ 孵化器在中等准备步骤1.4.2。
   4. 为了诱导类似DR的变化，含有DMEM-F12的介质培养视网膜外植物与Cyt、TNF-α（10 ng/mL）和IL-1+（10 ng/mL）相结合，具有32.5mM HG的组合。

2. 三明治视网膜外植的石蜡嵌入

1. 修复三明治视网膜外植。
   1. 将三明治视网膜除植物浸入 10% 正式植物中至少 24 小时。
   2. 取出正蛋白溶液，将三明治视网膜除植物轻轻地转移到纸巾和盒式磁带中。
   3. 将三明治视网膜除植物浸泡在 70% 乙醇中至少 24 小时。
   4. 石蜡嵌入视网膜外植成块。
   5. 使用微原子将石蜡嵌入的视网膜组织切成 5μm 厚的部分，并安装在玻璃滑梯上。在室温下储存，直到成像。
2. 去帕拉菲因化部分。
   1. 将部分浸入 70% 二甲苯中 5 分钟。
   2. 将部分浸入 100% 二甲苯中 5 分钟。
   3. 将 70% 乙醇中的部分补充水分 5 分钟。
   4. 将部分100%乙醇补水5分钟。
   5. 将自来水下的部分清洗10分钟。

3. 使用 H&E、IHC 和磁性发光检测进行特征分析

1. H&E 染色协议
   1. 使用步骤 2.2 对部分进行除以。
   2. 将部分水合在自来水中5分钟。
   3. 将吉尔的 2 血氧林溶液中的部分弄脏 5 分钟。
   4. 在自来水下彻底清洗部分，以去除多余的污渍。
   5. 区分通过浸渍两次在1%酸酒精。
   6. 在自来水下快速清洗部分。
   7. 将部分涂成蓝色，在 1% 碳酸锂（10 毫克/毫升）中浸渍六次。
   8. 在自来水下彻底清洗部分5分钟，去除多余的蓝色污渍。
   9. 将部分浸入 1% eosin 10 次。
   10. 在自来水下快速清洗部分，以去除多余的污渍。
   11. 脱水部分浸渍10次在100%乙醇。做两次。
   12. 将部分浸入 70% 二甲苯 10 次。
   13. 将部分浸入 100% 二甲苯 10 次。
   14. 使用二丁二甲酸酯聚苯乙烯 （DPX） 安装介质安装覆盖唇。
   15. 使用光显微镜拍摄图像。
2. IHC 标签协议 '
   1. 使用步骤 2.2 对部分进行除以。
   2. 将幻灯片放入包含 10 mM 柠檬酸钠缓冲液的溶液中，在 pH 6.0 时将 0.05% Tween 20 置于溶液中，并在 121 °C 自动压力锅中运行抗原检索，持续 2 分钟。
   3. 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中的洗涤部分 5 分钟。这样做3次。
   4. 在室温下，用含有 0.1% Triton X-100 和 10% 正常山羊血清的 PBS 将部分阻断 1 小时。
   5. 在 4 °C 下隔夜孵育部分，初级抗体与二级抗体（材料表）结合。
   6. 在 PBS 中清洗部分 5 分钟。这样做3次。
   7. 污渍核使用 4+，6-迪亚米迪诺-2-苯丙氨酸酯 （DAPI） 2 分钟。
   8. 使用防褪色试剂清洗和安装部分。
   9. 用指甲油密封盖片。
   10. 使用聚焦激光扫描显微镜拍摄图像。
3. 磁性发光检测
   1. 在 24 小时和 72 小时将 75 μL 的介质从每口井转移到 96 井 U 底板。
   2. 使用 Luminex 细胞因子检测分析 IL-18、IL-6、IL-8 和血管内皮生长因子 （VEGF） 的细胞超高分子。按照制造商的指示进行检测^16。

结果

视网膜完整性保留在这个HORC模型。 视网膜完整性保留在培养的三明治视网膜外植中，但在没有相邻结构的视网膜培养中丢失。H&E 进行了研究，以检查 72 小时后分片三明治视网膜外植的结构完整性。三明治视网膜外植显示出保存的完整性和独特的跛脚结构，从GCL到 ONL与紧凑的核在 INL 和 ONL （图4A）。然而，在同一样本的边缘发现视网膜...

讨论

HORC是目前临床前视网膜研究中最临床可翻译的模型。与体外细胞培养模型相比，HORC可以通过保留动态视网膜细胞类型及其与神经元、血管和细胞^外环境的连接，更好地在原地代表人类视网膜的解剖学。与动物模型相比，HORC在研究人类视网膜疾病的病理生理学和设计药物治疗方面更有利，因为物种间的变化，如不同的视网膜细胞类型以及不同的光受体密度和比例，尽管动物模型<...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Disposable Biopsy Punches (5 mm)	Integra York PA Inc., USA	21909-142	Referred as surgical trephines in this article
Human Recombinant IL-1β	Peprotech, USA	200-01B	Working concentration: 10 ng/mL
Human Recombinant  TNF-a	Peprotech, USA	300-01A	Working concentration: 10 ng/mL
DAPI (1 µg/mL)	Sigma Aldrich, Germany	#D9542	Nuclear stain. Working dilution 1:1000
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Gibco, Thermofisher, Scientific Inc., USA	10565018	Dulbecco’s Modified Eagle Medium nutrient mixture F-12 containing a 1× antibiotics and antimycotics mixture (AA, 100× stock)
Fine Scissors - Sharp-Blunt	Fine Science Tools (F.S.T)	14028-10	Tips: Sharp-Blunt, Cutting Edge: 27mm, Length: 10cm, Alloy/Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight
Graefe Forceps	Fine Science Tools (F.S.T)	11050-10	Length:10cm, Tip shape: Straight, Tips: Serrated, Tip Width: 0.8mm, Tip Dimensions:0.8 x 0.7mm, Alloy/Materials: Stainless Steel
Mouse monoclonal GFAP-Cy3	Sigma Aldrich, Germany	#C9205	Primary antibody conjugated to Cy3. Working dilution 1:1000.
Mouse monoclonal Vimentin-Cy3	Sigma Aldrich, Germany	#C9080	Primary antibody conjugated to Cy3. Working dilution 1:50.
Rabbit polyclonal TUNEL (In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein)	Sigma Aldrich, Germany	#11684795910	Primary antibody conjugated to Fluorescein-dUTP. Working dilution 1:10 with enzyme-buffer solution.